基于质谱技术鉴定由Thermococcus onnurineus Cas10产生的AMP-O-Tris

《FEBS Open Bio》：Mass spectrometry based identification of AMP-O-Tris generated by Thermococcus onnurineus Cas10

　　摘要

Cas10是III型CRISPR–Csm系统的催化核心，它合成环状寡腺苷酸（cOA）这种第二信使分子以激活下游的免疫反应。尽管Cas10的活性受到复杂组装过程的调控，但分离出的Cas10的亲核试剂选择性和非途径反应性仍知之甚少。在这里，我们利用高效液相色谱（HPLC）分离和随后的串联质谱（MS/MS）分析，鉴定并表征了AMP-O-Tris这一由Thermococcus onnurineus的Cas10产生的非典型腺苷化产物。我们的研究结果表明，纯化的Cas10表现出较低的亲核试剂选择性，导致ATP转化为涉及缓冲液来源亲核试剂的非生产性腺苷化反应。这表明效应复合体的组装限制了Cas10的反应性，从而促进了cOA的有效合成并抑制了非途径化学反应。此外，缓冲液来源的亲核试剂对反应中间体的拦截可能代表了一种潜在的化学安全机制，可以在Cas10与复合体分离时防止意外的信号传导。总的来说，我们的研究为Cas10的调控机制提供了见解，并为开发基于III型的诊断平台提供了理论支持。

影响声明

我们的研究表明，当Cas10被分离出来时，它表现出潜在的催化灵活性，鉴定出了一种非典型的腺苷化反应。这些发现揭示了复杂组装如何限制酶的特异性，以防止异常信号传导。这一机制性见解对于提高下一代基于CRISPR的诊断平台的准确性和设计至关重要。

缩写

CID：碰撞诱导解离

cOA：环状寡腺苷酸

HPLC：高效液相色谱

MS：质谱

MS/MS：串联质谱

III型CRISPR–Csm系统通过RNA引导的干扰机制与基于核苷酸的信号通路相结合，为细菌和古菌提供适应性免疫[[1, 2]]。这些系统组装多亚基效应复合体，识别目标RNA并触发协调的RNA切割、DNA靶向和第二信使信号传导[[3-5]]。遗传和生化研究表明，这些活性的失调可能导致自身免疫，这突显了严格控制效应功能的必要性[[3, 4, 6]]。这些复合体的核心是Cas10（在III-A系统中也称为Csm1），这是一种多结构域酶，它催化ATP依赖的腺苷化反应，生成环状寡腺苷酸（cOA）分子[[7-9]]。这些核苷酸衍生的第二信使分子激活下游的效应蛋白，如CARF结构域的核糖核酸酶（包括Csm6），从而增强抗病毒反应[[7-9]]。Cas10作为连接RNA感知和基于核苷酸的信号传导的中心枢纽的作用在多种III型CRISPR系统中已经得到充分证实[[7-10]]。生化和结构研究表明，目标RNA与Csm效应复合体的结合激活了Cas10的Palm聚合酶结构域，导致cOA的合成[[7, 8, 11]]。值得注意的是，对Thermococcus onnurineus的Csm复合体的结构和生化分析表明，组装的效应复合体主要产生cOA4，同时还有可检测水平的cOA3，为该生物体中典型的Cas10依赖性信号传导提供了明确的基线[[12]]。生成的cOA分子通过别构作用激活辅助核酶，包括Csm6，这些核酶在免疫反应中参与RNA的降解[[7-9]]。为了防止过度或持续的活动，cOA信号传导受到专门的环状寡腺苷酸降解酶的严格调控，这些酶能够终止信号传导[[13, 14]]。综上所述，这些发现强调了在组装的CRISPR效应复合体内精确控制Cas10衍生的核苷酸化学的重要性[[9, 10, 13, 14]]。因此，Cas10的活性被广泛认为受到其整合到多蛋白Csm复合体中的严格调控，这确保了适当的底物识别并促进了典型的反应途径[[9, 10]]。对Thermococcus onnurineus的Csm1亚基的结构分析揭示了其多结构域架构，包括一个具有单链DNA特异性核酸酶活性的N端HD结构域，这突显了Cas10家族蛋白的催化多样性，同时也强调了复合体组装在塑造其功能输出中的作用[[15]]。随后的冷冻电镜（cryo-EM）和晶体学研究进一步表明，RNA介导的激活诱导了Csm复合体的协调构象重排，直接将RNA结合与Cas10的激活联系起来[[16, 17]]。尽管取得了这些进展，但Cas10在分离状态下的内在催化行为，特别是在亲核试剂选择性和腺苷化特异性方面，仍有待完全阐明。最近的系统和生化分析表明，分离出的Cas10蛋白在没有完整监控复合体的情况下几乎不产生或完全不产生环状寡腺苷酸，这突显了多蛋白组装对于功能激活的重要性[[18]]。这一点尤为重要，因为III型CRISPR–Cas系统最近已成为下一代RNA诊断的强大平台，在这种平台上，Cas10介导的信号放大必须严格与目标识别相关联[[19]]。在这项研究中，我们检测了在体外条件下由T. onnurineus分离出的Cas10产生的ATP依赖性反应产物。通过基于质谱的分析，我们鉴定出了AMP-O-Tris，这是一种通过AMP与缓冲液成分Tris（一种先前在非酶促ATP化学中观察到的亲核试剂）共价连接而形成的非典型腺苷化产物[[20]]。我们的研究结果表明，当Cas10从其天然的多蛋白复合体中分离出来时，它表现出潜在的催化灵活性，并表明复合体的形成在限制底物选择和抑制CRISPR相关酶促活动中的非生产性副反应方面起着关键作用。本文概述的III型CRISPR–Csm复合体的整体功能以及Cas10的位置在图1中以示意图形式呈现。这些发现为提高基于CRISPR的诊断工具的准确性和灵敏度提供了机制基础。

图1：III型CRISPR–Csm复合体内Cas10的功能概述。示意图展示了III型CRISPR–Csm效应复合体，突出了RNA引导的目标识别与Cas10介导的单链DNA切割和环状寡腺苷酸（cOA）合成。结构可视化是使用基于RCSB蛋白质数据库中可用结构的PyMOL软件进行的。

材料与方法

蛋白质表达和纯化

从T. onnurineus中获得的重组Cas10按照先前的描述在大肠杆菌BL21（DE3）中表达[[11]]。编码Cas10的基因被克隆到一个含有N端His?标签的表达载体中。通过在培养基中对数中期添加0.5 mM异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷来诱导蛋白质表达，然后在18°C下孵育约18小时。通过离心收集细胞，并将其重新悬浮在裂解缓冲液中，该缓冲液包含30 mM Tris–HCl（pH 8.0）、500 mM NaCl、5 mM β-巯基乙醇和1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）。通过超声处理裂解细胞，并通过离心去除不溶性物质。澄清的裂解液应用于Ni–NTA亲和层析树脂，用相同的裂解缓冲液洗涤，然后使用含有250 mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱Cas10。洗脱的蛋白质组分用含有50 mM Tris/HCl（pH 8.0）、300 mM NaCl和5 mM β-巯基乙醇的缓冲液进行透析，随后使用Superdex 200 Increase 10/300 GL进一步纯化。通过SDS/PAGE评估蛋白质纯度。通过定点突变生成携带保守GGDD基序突变的催化失活Cas10变体，并使用与野生型Cas10相同的程序进行纯化。Cas10–Csm4亚复合体是通过在E. coli中使用pRSF-Duet表达载体共表达Cas10和Csm4来制备的，遵循先前的描述[[11]]。亚复合体使用上述相同的亲和层析和GPC程序进行纯化。

体外Cas10反应测定

ATP依赖性反应是通过在基于Tris的反应缓冲液中孵育纯化的Cas10来进行的，遵循已建立的Cas10核苷酸反应测定方法[[7, 8]]。除非另有说明，反应在总体积为20 μL的缓冲液中进行，其中包含50 mM Tris/HCl（pH 8.0）、500 μM ATP和1 μM纯化的Cas10，以及二价金属离子（NiCl2或ZnCl2，浓度为毫摩尔级）。反应在55°C下孵育最多24小时。对照反应在没有酶的情况下进行，或者使用催化失活的Cas10变体，在其他条件相同的情况下进行。对于金属依赖性测定，在反应开始前加入EDTA。对于缓冲液依赖性实验，用不含伯醇基团的替代缓冲液替换Tris，同时保持相似的pH值和离子强度。

放射标记TLC分析

反应产物通过薄层色谱（TLC）进行分析，使用放射标记的核苷酸，如之前对Cas10介导的ATP处理所描述的[[7]]。对于TLC测定，反应的组装方法如上所述，并使用[α-32P]ATP作为ATP底物。反应混合物直接加载到聚乙烯亚胺（PEI）-纤维素TLC板上。TLC板在含有0.8 M醋酸、20%（v/v）乙醇和0.5 M LiCl的活化缓冲液中展开。展开后，板子风干，并通过自动放射照相法检测放射性信号。放射标记的ATP标准品是从[α-32P]ATP制备的。放射标记的ADP是通过在37°C下将[α-32P]ATP孵育30分钟生成的，而放射标记的AMP是通过在95°C下热处理ATP制备的，如之前所述[[7]]。所有涉及放射性材料的实验都按照机构辐射安全规定进行。

高效液相色谱

反应混合物通过反相高效液相色谱进行分析，使用配备UV检测器和Supelco Ascentis? C18柱（5 μm，4.6 × 250 mm，部件编号58348）的Shimadzu Prominence HPLC系统（LC-20AT）进行，遵循已建立的Cas10衍生核苷酸产物分离方法[[7-9]]。分离在28°C下进行，流速为1.3 mL·min?1。流动相包括洗脱液A（0.1 M KH2PO4，pH 4.6）和洗脱液B（洗脱液A：甲醇，90∶10，v/v）。应用线性梯度程序如下：0–9分钟，0% B；9–15分钟，线性增加到25% B；15–17.5分钟，线性增加到90% B；17.5–19分钟，增加到100% B；19–23分钟，保持在100% B进行柱子清洗；23–24分钟，返回到0% B进行重新平衡。总运行时间为24分钟。洗脱在254 nm处监测，保留时间与核苷酸标准品（ATP、ADP、AMP）进行比较。收集与新观察到的峰对应的组分进行质谱分析。由于磷酸盐缓冲液会干扰MS分析，类似的实验在兼容MS的缓冲液条件下进行。然而，在无磷酸盐条件下，新观察到的峰在色谱上与反应混合物分离不佳，尽管在MS光谱中仍能检测到产物信号。由于在线LC–MS分析期间目标峰的洗脱窗口较窄，限制了详细表征，因此这些组分被单独收集。这些组分随后通过低流速直接注入LTQ-Orbitrap Elite（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）质谱仪进行MS?分析，以允许更长的分析时间。

质谱和串联MS分析

收集的HPLC组分通过直接注入LTQ-Orbitrap Elite质谱仪进行分析，该质谱仪配备有双压力线性离子阱和Orbitrap分析器。使用双压力线性离子阱分析器获取MSn碎片数据以进行样品的结构表征。碎片化在负离子模式下进行，使用碰撞诱导解离。样品通过注射器以1 μL·min?1的流速注入，通过安装在EASY-Spray?源（P/N ES081；Thermo Fisher Scientific）上的20 μm ID针头引入。系统在没有护套或辅助气体的情况下运行。喷射电压设置为1.9 kV。离子转移管保持在320°C的温度。LTQ数据以正常分辨率获取。根据离子强度和MSn水平设置隔离窗口为1–4 Th。

结果

分离出的Cas10产生一种与典型核苷酸不同的ATP衍生产物

为了研究Cas10的固有催化活性，将来自T. onnurineus的纯化Cas10在标准体外反应条件下与ATP一起孵育。首先通过薄层色谱（TLC）分析反应产物，并与核苷酸标准品进行比较。在含有Cas10的反应中，始终观察到一个额外的斑点，其迁移位置与ATP、ADP或AMP不同，而在无酶的对照反应中未检测到此类产物（图2A）。这个额外物种的出现依赖于Cas10的存在，并且在单独孵育ATP时没有观察到，表明它不是由ATP在实验条件下的自发降解产生的。图2显示了由分离出的Cas10产生的ATP衍生产物的检测。（A）TLC分析显示，在Cas10存在的情况下，与ATP、ADP和AMP不同的迁移位置的额外斑点。（B）相同反应混合物的HPLC分析显示了一个保留时间为10.5分钟的额外峰，该峰不对应于已知的核苷酸标准品。检测使用HPLC-UV在254 nm下进行。与TLC结果一致，高效液相色谱（HPLC）分析在254 nm波长下检测到一个额外的峰，其保留时间为10.5分钟（图2B），该峰不对应任何已知的核苷酸标准物，包括ATP、ADP或AMP（图2C）。在相同的反应条件下进行的独立实验中，这一峰的形成是可重复的，并且随着孵育时间的延长而增加。TLC和HPLC观察到的独特色谱行为表明，形成的是一种化学修饰的ATP衍生物，而不是已知的ATP水解中间体。这些观察结果共同表明，孤立的Cas10产生的ATP衍生物与由活化的III型CRISPR-Csm复合体合成的典型环状寡腺苷酸（cOA3–cOA6）不同[[7-9, 12]]。通过质谱分析鉴定出Cas10依赖的产物为AMP-O-Tris。

为了确定新观察到的产物的化学身份，收集了相应的HPLC组分并进行了质谱分析。高分辨率质谱显示出一个质量与含有AMP的加合物形成一致的显著离子种类。为了确认产物的结构，选择了m/z 449.09的前体离子，并使用碰撞诱导解离（CID）技术进行MSn分析，碰撞能量为30。随后的MSn分析产生了与AMP部分以及来自Tris的片段相对应的特征碎片离子（图3）。

为了评估AMP-O-Tris的形成是否需要Cas10的催化活性，在没有酶的情况下或使用携带保守GGDD基序（GGAA）突变的无催化活性Cas10变体进行了对照反应，其他条件相同。在缺乏Cas10的反应中，质谱未检测到AMP-O-Tris信号，表明该产物不是在实验条件下ATP自发化学反应产生的。同样，即使蛋白质浓度和孵育时间相当，含有GGAA变体的反应也未能产生可检测的AMP-O-Tris（图4A）。

在不同反应和组装条件下，通过Cas10生成的ATP衍生物的代表性HPLC色谱图如下：(A) 催化活性Cas10与无活性的GGAA变体相比，只有活性Cas10时观察到AMP-O-Tris的形成；(B) 在EDTA等金属离子螯合剂存在下，AMP-O-Tris的形成被抑制，表明需要二价金属离子；(C) 当Tris被替换为缺乏伯醇基团的缓冲液时，AMP-O-Tris的形成被消除；(D) 在含有Cas10–Csm4亚复合体的反应中也检测到了AMP-O-Tris的形成。相比之下，含有催化活性Cas10的反应始终产生AMP-O-Tris。此外，在金属离子螯合剂存在下，AMP-O-Tris的形成也被抑制，表明反应严格依赖于二价金属离子（图4B）。这些结果表明，AMP-O-Tris的形成依赖于Cas10的催化机制以及金属离子的协调作用，并且是由酶介导的化学反应产生的，而不是非特异性的ATP反应。在含有纯化的Cas10、ATP和基于Tris的缓冲液的反应条件下也观察到了AMP-O-Tris的形成。当Tris被替换为缺乏伯醇基团的替代缓冲液时，AMP-O-Tris的形成被消除，表明缓冲液中的亲核试剂直接参与了产物的形成（图4C）。这一缓冲液依赖性进一步支持了观察到的产物是由涉及外源性亲核试剂的非典型腺苷化反应产生的解释。在含有Cas10–Csm4亚复合体的反应中也检测到了AMP-O-Tris的形成（图4D），表明部分复合体组装不足以完全抑制这种非典型活性。这些观察结果表明，孤立的Cas10足以在体外条件下催化AMP-O-Tris的形成，并且这一反应独立于完整的Csm复合体组装或目标RNA的结合。

在这项研究中，我们证明了从T. onnurineus中分离出的Cas10在标准体外条件下催化一种非典型的ATP依赖性腺苷化反应，生成AMP-O-Tris。这一反应对保守的GGDD催化基序和二价金属离子的严格依赖性表明，AMP-O-Tris的形成是由负责典型环状寡腺苷酸（cOA）合成的相同催化机制介导的[[7-9]]。这些结果表明，当Cas10从其天然的多蛋白环境中分离出来时，其亲核试剂的选择性会减弱，允许小的外源性分子在ATP转化过程中截获腺苷化中间体。AMP-O-Tris的形成揭示了效应复合体组装在III型CRISPR-Csm系统中的调节作用。与简单地激活Cas10不同，Csm复合体的组装似乎限制了Cas10活性位点可接触的化学空间，促进了有效的cOA合成，同时抑制了非生产性的副反应。因此，与辅助亚基和目标RNA的相互作用可能限制了溶剂的进入，并精确定位了生理亲核试剂，确保了ATP消耗与体内第二信使生成的有效耦合[[11, 16, 17]]。这些发现为III型CRISPR系统的体外研究提供了机制上的见解。基于Cas10的ATP转化越来越多地被用于依赖于cOA依赖性激活CARF结构域效应因子的CRISPR诊断平台中[[19]]。我们的结果表明，在某些反应条件下，ATP也可能被引入非典型的腺苷化反应，特别是在含有Tris的缓冲液中或当Cas10在效应复合体内未完全组装时，这可能会影响ATP用于有效cOA合成的可用性，并可能影响反应效率或体外背景活性。这些观察结果强调了在设计 and 解释涉及III型CRISPR系统的实验时，反应条件（包括缓冲液组成和酶组装状态）的重要性。除了技术考虑之外，孤立的Cas10观察到的催化行为还引发了有趣的进化学意义。尽管Cas10的活性通常受到组装好的CRISPR-Csm复合体的限制，但短暂的解离事件、不完全组装或辅助亚基的选择性降解可能会释放出具有催化活性的Cas10结构域。在这种情况下，不受限制的Cas10活性可能会带来异常第二信使产生的风险。我们的发现表明，细胞中含伯醇代谢物的丰富可能会降低这种风险：即使自由的Cas10仍然具有活性，ATP的醇解也可能将反应中间体转化为不再适合作为第二信使的醇结合腺苷化产物[[20]]。从这个角度来看，醇介导的Cas10活性转移可能作为一种内在的化学安全机制，中和了孤儿Cas10酶的意外信号传导。或者，由孤立的Cas10结构域生成的醇结合核苷酸可能参与尚未被识别的信号传导或调节途径。虽然这是推测性的，但这种可能性扩展了CRISPR相关核苷酸化学的概念框架。总之，我们的工作揭示了Cas10中通常受到效应复合体组装限制的潜在催化灵活性。这种灵活性强调了多蛋白组织在指导CRISPR酶化学向有效免疫信号传导方向上的重要性，同时提出了限制非预期第二信使活性的化学和进化机制。这些见解加深了我们对Cas10调控的理解，并为基于CRISPR的生物化学和诊断平台的设计提供了依据。

这项工作得到了韩国国家研究基金会（NRF）（由韩国政府（MSIP）资助，项目编号RS-2022-NR071772、RS-2021-NR059435和RS-2021-NR056526）、国家科学技术研究委员会（NST）（CRC22024-500）以及KRIBB研究计划（KGM5382632、KGM1062612、KGM1322612）的支持。人工智能使用声明：仅使用人工智能辅助的语言编辑工具来改进语法和可读性。作者审查并编辑了输出内容，并对稿件的内容负全责。

作者声明没有利益冲突。

这项研究由E-JW和S-JL共同构思，E-JW、J-HM、J-HK、S-RG、K-HP和S-JL提供了科学和实验建议。S-JL和G-SL进行了实验并制作了图表。手稿由S-JL和E-JW撰写，所有作者都参与了意见的提供。

本文的同行评审历史可在以下链接查看：https://www.webofscience.com/api/gateway/wos/peer-review/10.1002/2211-5463.70235。

本研究生成或分析的所有数据均包含在本文中。