《Journal of Separation Science》：Recent Developments and Applications of Capillary and Microchip Electrophoresis in Proteomics and Peptidomics (2023–2025)
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这篇综述全面总结了2023至2025年间毛细管电泳（CE）和微芯片电泳（MCE）在蛋白质组学与肽组学研究中的进展与应用。文章从样品制备、与质谱（MS）的联用（特别是电喷雾离子化质谱 ESI-MS 及多维联用）、自下而上蛋白质组学（BUP）和自上而下蛋白质组学（TDP）等核心方法学创新入手，系统梳理了该领域的技术发展。此外，综述还重点展示了这些技术在监测翻译后修饰（PTM）、基础生化研究、临床样本（如尿液、血浆）分析以及食品检测等方面的具体应用实例，充分体现了CE/MCE方法在分析复杂生物样本时的高效、微量、快速和正交互补性优势。
引言
蛋白质和肽是生命体中至关重要的生物大分子，调控着众多关键的生化过程。蛋白质组学是对蛋白质的大规模研究，旨在从分子层面全面了解健康机体以及在各种疾病、紊乱或特殊条件下发生的变化。由于生物样本的高度复杂性，质谱（MS）分析常需与液相分离技术联用。反相液相色谱-质谱联用（RPLC-MS）是蛋白质组学和肽组学研究中的常用技术，而毛细管电泳-质谱联用（CE-MS）则因其正交性、高分离效率、快速分析、样品及缓冲液消耗量极小等特点，成为其有力补充和替代选择，尤其适用于单细胞分析等纳米尺度组学研究。本综述旨在呈现2023-2025年间CE和MCE在蛋白质组学及肽组学分析中的新趋势与有趣应用。
样品制备
样品制备是蛋白质组学和肽组学研究工作流程中至关重要的一环。自下而上蛋白质组学（BUP）的典型流程包括细胞裂解/均质化、蛋白质提取/沉淀、还原、烷基化、酶解、脱盐和分馏。常用的蛋白酶是胰蛋白酶，但也有使用其他特异性蛋白酶（如胰凝乳蛋白酶、Lys-C等）的情况。毛细管内酶解（ICD）-CE-MS被用于帕金森病生物标志物α-突触核蛋白（α-syn）的BUP分析，并成功检测到人红细胞内源性α-syn的乙酰化及潜在磷酸化肽段。固定化酶反应器（IMER）相比传统溶液酶解具有防止蛋白酶自溶、缩短消化时间、减少试剂消耗等优势。
与BUP不同，自上而下蛋白质组学（TDP）避免了酶解步骤，直接对完整蛋白质（蛋白质形式）进行分析，能够区分由同一基因产生的、因遗传变异、选择性RNA剪接和翻译后修饰（PTM）而导致分子结构不同的各种蛋白质形式（Proteoform）。TDP的样品制备策略包括靶向和非靶向的蛋白质富集与复杂度降低方法，如尺寸排阻色谱（SEC）、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）等。
CE因所需样品量极少，特别适用于单细胞蛋白质组学等纳米级组学研究。自动化喷雾-毛细管平台、反相-固相微萃取（RP-SPME）-CZE-MS/MS系统、新型机器人毛细管（RoboCap）平台以及结合声悬浮液滴富集的RoboCap CE-ESI-MS等方法，都成功实现了对极低量（低至单细胞水平）蛋白质组消化物的高效分析。此外，纳米颗粒（NP）蛋白冠样本制备与CZE-MS/MS联用，可降低血浆蛋白质组的复杂度，有助于发现新的潜在癌症生物标志物。
在肽组学中，为富集内源性肽并去除高丰度蛋白质、盐分等干扰物，常采用有机溶剂沉淀、离心超滤、差异溶解和固相萃取（SPE）等策略。为提高CE分析的灵敏度，可采用多种在线和离线预富集策略。多组学分析的样品制备需在均质化后平等分配样品用于各“组学”分析。蛋白质组分析的绿色化要求聚焦于设备小型化、使用在线样品制备技术、更环保的溶剂和试剂以及更可持续的材料。
CE和MCE方法与质谱的联用
质谱是肽组学和蛋白质组学分析的主要工具，可分为定性和定量分析。定量策略包括标记和无标记两种。基于标记的定量常采用稳定同位素标记，如细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记（SILAC）、串联质量标签（TMT）、同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）以及酶促18O标记。
质谱可在变性或天然条件下进行。天然蛋白质组学旨在保持蛋白质非共价相互作用，在接近生理条件下研究内源性蛋白质和蛋白质复合物。天然CZE与超高质量范围Orbitrap质谱仪联用，可在单次1小时分析中检测到大肠杆菌（E. coli）细胞裂解液中72种蛋白质形式或蛋白质复合物（质量范围30-400 kDa），仅消耗50 ng样品。
一维CE方法与ESI-MS及ESI-MS/MS联用
电喷雾离子化质谱（ESI-MS）是蛋白质组学研究的主要方法。ESI可产生多电荷离子，有效降低分析物离子的质荷比（m/z），从而测量大质量蛋白质或肽。CE与ESI-MS的联用接口不断改进，例如用于毛细管等电聚焦（CIEF）-ESI-MS的在线自动去盐接口，可有效去除两性电解质，提高峰面积。此外，研究证实CZE与离子淌度质谱（IM-MS）是正交的分离方法，合并峰容量可达9500。基于液结原理的新型纳喷接口、用于氢氘交换（HDX）研究的CE-ESI-MS以及结合离子淌度的CE-ESI-MS等方法也被开发并应用于蛋白质组学分析。
多维CE和LC-CE方法与MS联用
多维分离方法能显著提高复杂样品中低丰度物质的鉴定数量。例如，SDS-PAGE蛋白质分馏（PEPPI-MS）与CZE-MS/MS联用可鉴定组蛋白的蛋白质形式；二维反相纳流液相色谱-毛细管区带电泳-质谱（2D RP nanoLC-CZE-MS）平台用于非靶向TDP，比一维方法检测到更多的蛋白质形式。空间三维微芯片整合了IEF、SEC和RPLC，预测可在1小时内实现超过30，000的峰容量。
自下而上蛋白质组学
自下而上蛋白质组学（BUP）是分析复杂混合物中蛋白质的主要方法。其工作流程包括样品制备、酶解、LC或CE分离、MS检测与测序以及生物信息学分析。肽段通常Mr < 3 kDa。RPLC-MS是BUP的常用平台，CZE-ESI-MS也有应用。
在CZE-MS蛋白质组学研究中，传统上使用数据依赖性采集（DDA），但数据非依赖性采集（DIA）能选择预设m/z窗口内的所有前体离子进行MS/MS碎裂分析。研究表明，对于12.5 ng HeLa细胞消化物，CZE-DIA-MS鉴定的肽段和蛋白质数量分别是CZE-DDA-MS的1.8倍和2倍。通过提高分离电压、使用DIA模式以及结合电泳关联数据非依赖性采集（Eco-DIA）和人工智能辅助谱图去卷积（Real-Time Eco-AI）等策略，单细胞蛋白质组学的通量和灵敏度得到显著提升。串联质量标签（TMT）多重定量在CE-ESI-MS和nanoLC-MS中的重现性和准确性相当，但CE的灵敏度提高了约12倍。
自上而下蛋白质组学
自上而下蛋白质组学（TDP）用于生物样品中蛋白质形式的鉴定和表征。其工作流程包括蛋白质提取、蛋白质形式分离、MS质量测定与碎裂以及生物信息学数据分析。RPLC-MS常用于TDP，而CZE-MS可作为互补手段，两者结合可提高蛋白质形式的覆盖度。
CIEF-MS/MS TDP可用于分析纳米颗粒蛋白冠中不同基因产物的蛋白质形式，鉴定出70多种与癌症相关基因的蛋白质形式。改进的CIEF-MS/MS方法将分析时间缩短至30分钟，迁移时间RSD<4%。CZE-MS/MS结合SEC分馏用于植物拟南芥叶片组织的TDP，鉴定出大量具有PTM的蛋白质形式。将高场不对称波形离子迁移谱（FAIMS）与CZE-MS/MS联用，用于复杂蛋白质组（酵母裂解液）的TDP，使蛋白质形式的鉴定数量提高了约3倍，信噪比提高约20倍。CZE-FAIMS-MS/MS应用于组蛋白TDP，鉴定出的组蛋白蛋白质形式数量是未使用FAIMS时的3倍。
动态pH梯度CZE-MS/MS结合CZE-FAIMS-MS/MS和RPLC-MS/MS，可从人血浆孵育的聚苯乙烯纳米颗粒的蛋白冠中鉴定出883种蛋白质形式。CZE-MS/MS结合SEC分馏用于膜蛋白（IMP）的TDP，从小鼠脑样本中鉴定出大量IMP。喷雾-毛细管-CE-MS平台用于50 pg大肠杆菌裂解液的TDP分析，可检测到超过200种蛋白质形式。多段样品进样与喷雾-毛细管-CE-MS平台集成，可在单次运行中注入多达17个样品段。对CZE-MS/MS长期重现性的研究表明，经过适当清洗，LPA涂层毛细管可进行超过23次重现性良好的测量。采用阳离子可调EOF的涂层毛细管（如PAMAPTAC涂层、APTAC涂层、阳离子磺基甜菜碱修饰聚赖氨酸涂层）可改善完整蛋白质和蛋白质形式的分离，尤其适用于具有酸性PTM（如磷酸化、糖基化、乙酰化）的大蛋白质。
一项跨国多实验室研究应用CZE-MS对两种模型蛋白质形式混合物进行了TDP分析，结果表明各实验室间迁移时间RSD<1%，且CE-MS与LC-MS是高度互补的技术。
应用
翻译后修饰监测
翻译后修饰（PTM）通过改变蛋白质的结构和生物学功能来增加其多样性。异常的PTM在疾病发展中起重要作用。PTM研究可采用BUP、TDP以及肽图分析方法。
CZE-MS TDP和中下蛋白质组学（MDP）用于表征G蛋白偶联受体（GPCR）的蛋白质形式，鉴定出人β2-肾上腺素能受体的9种蛋白质形式并定位了多个磷酸化位点。CZE-MS/MS和RPLC-MS/MS结合用于重组人tau-0N3R蛋白的BUP分析，两种方法在表征tau蛋白PTM方面高度互补。伪天然CIEF-MS观察到三种带有磷酸基团的推定tau-0N3R二聚体。集成SPE的微芯片CZE-MS装置用于分析磷酸化肽段标准品和小鼠脑组织磷酸化肽段富集物，对许多标准品在640 zmol水平即可实现可靠定量。
基础生物学与生化研究
蛋白质组学研究有助于增进对复杂生物系统的理解。CE-MS技术已成功应用于单细胞蛋白质组学分析。电泳关联数据非依赖性采集（Eco-DIA）利用CE-MS在液相中按m/z与迁移时间趋势“分选”肽段离子的特性，提高了单细胞蛋白质组学的灵敏度。结合离子淌度质谱（IMS）的Eco用于分析非洲爪蟾胚胎动物冠单个体细胞，定量揭示了不同卵裂球之间的差异。结合DDA、Eco离子分选和人工智能辅助谱图去卷积（Real-Time Eco-AI）的CE-MS，成为一种高性价比的单细胞蛋白质组学解决方案。CE-LIF方法初步实现了单细胞水平人表皮生长因子受体-2（HER2）膜蛋白拷贝数的定量。CE-ESI结合淌度质谱和超分辨率显微镜，用于表征视交叉上核（SCN）在睁眼前后的蛋白质组变化，发现了166个在发育过程中发生显著变化的蛋白质。
临床研究
蛋白质组学和肽组学策略用于发现、确定和验证临床相关的生物标志物，以改进疾病早期检测、预后判断、治疗反应预测或监测饮食干预效果。
CE-MS已广泛应用于尿液肽组学和蛋白质组学分析，用于多种疾病的诊断和预后判断。例如，研究年轻人高血压的尿液肽组学特征，发现了一些可能与高血压相关的胶原蛋白片段。通过CE-MS分析前列腺癌患者和非癌性前列腺疾病患者的尿液内源性肽段，基于机器学习构建了由181个生物标志物组成的模型，在前列腺癌检测中表现出良好的准确性。尿液分析还可用于骨质疏松症、SARS-CoV-2感染急性后遗症、早产儿临床并发症等疾病的研究。CE-MS也应用于血浆、脑脊液、唾液等其他体液的肽组/蛋白质组分析。CZE-MS分析了慢性肾脏病和终末期肾衰竭患者的血浆样本，建立的模型可高精度区分透析前后样本。CZE-MS/MS用于人唾液肽组分析，揭示了早餐前后唾液肽组成的显著变化。
定量TDP结合SDS-PAGE分馏和CE-MS分析，比较了转移性（SW620）和非转移性（SW480）结直肠癌（CRC）细胞之间的组蛋白蛋白质形式差异，发现组蛋白H4的乙酰化形式以及具有N端乙酰化和磷酸化的组蛋白H2A形式可能作为CRC转移的潜在生物标志物。结合SEC分馏的定量TDP发现了健康大脑和阿尔茨海默病（AD）大脑样本之间的显著差异。采用新型聚合物涂层的CZE-ESI-MS/MS分析了非小细胞肺癌组织及其癌旁组织，主成分分析（PCA）显示CE-MS数据能将肿瘤组织和癌旁组织样本区分开。
食品分析
肽组学和蛋白质组学应用于食品分析的不同领域，如确定食品质量、来源、真实性、掺假，鉴定和表征生物活性肽，或测定蛋白质过敏原。
CE用于检测七种乳类（水牛、牦牛、山羊、绵羊、骆驼、马、驴）及乳制品（生乳、巴氏杀菌乳、冻干和喷雾干燥乳粉）中牛乳的掺假，牛αs1-酪蛋白、β-乳球蛋白和β-酪蛋白A1是可靠的生物标志物，最低检测限为2%。MCE也用于检测牛奶中掺入的干酪乳清。
