乙烯响应性转录因子通过调节GABA代谢，在控制气氛储存条件下减轻新鲜带壳核桃（Juglans regia L.）的褐变现象

《Postharvest Biology and Technology》：Ethylene responsive transcription factors alleviate browning in fresh in-hull walnut ( Juglans regia. L) by modulating GABA metabolism under controlled atmosphere storage

核桃壳褐变调控机制；γ-氨基丁酸代谢；乙烯响应因子；GAD4基因；低氧调控

　　

Niu Ye|Guoli Dai|Shizhe Liu|Yongqi Zhang|Shan Liu|Sike Wang|Yuwei Wang|Yuanlin Gou|Ting Zhang|Yanping Ma|Qinggang Zhu|Huiling Ma

西北农林科技大学生命科学学院，中国陕西省杨陵市712100

摘要

先前的研究发现，γ-氨基丁酸（GABA）与在控制气氛（CA）储存条件下新鲜带壳核桃褐变的缓解密切相关。然而，其背后的分子机制仍不清楚。本研究探讨了在CA条件下（5 kPa O?和7.5 kPa CO?），单独使用或结合外源性GABA和GABA合成抑制剂时，GABA代谢途径的调节机制，以及其在缓解新鲜带壳核桃壳褐变中的作用。结果表明，CA增强了谷氨酸脱羧酶（GAD，GABA合成酶）的活性，从而增加了GABA的积累，并保持了较高的GABA转氨酶（GABAT）活性。瞬时过表达和基因沉默实验表明，GAD基因JrGAD4调控核桃壳的褐变。RNA测序数据鉴定出几种对CA响应的乙烯响应因子（ERFs）。双荧光素酶测定显示JrERF27、JrERF10和JrERF28能够激活JrGAD4启动子。酵母单杂交实验确认这些ERFs与JrGAD4启动子结合。此外，双荧光素酶测定、萤火虫荧光素酶互补成像、酵母双杂交实验和双分子荧光互补实验证明了JrERF27、JrERF10和JrERF28之间的蛋白质-蛋白质相互作用。在核桃果实中瞬时过表达JrERF27、JrERF10和JrERF28，无论是单独还是联合使用，都能通过调节JrGAD4的转录有效激活GABA代谢途径。相反，这些ERFs的瞬时沉默抑制了JrGAD4转录本的积累。总之，这些数据表明，从生理和分子角度来看，GAD是CA激活GABA代谢的关键靶点。此外，在低氧CA条件下，JrERF27、JrERF10和JrERF28作为JrGAD4基因的直接转录激活因子，从而调节GABA的生物合成并减轻果实褐变。

引言

意外的氧气水平降低和水浸环境会导致植物出现低氧胁迫，这会挑战它们在自然和农业生态系统中的生长和适应性。极端缺氧最显著的影响之一是三羧酸（TCA）循环的破坏，以及无法为线粒体电子传递链提供能量以产生ATP（Banti等人，2013年）。当氧气浓度降至某个临界水平以下时，无氧呼吸（也称为发酵）开始产生能量，如果持续时间过长，植物会受到损害（Boamfa等人，2005年；Li等人，2023年）。由N端降解途径控制的缺氧响应转录因子（TF）VII组ERFs的稳定性被认为可以激活与无氧呼吸相关的基因，如PDC1和ADH1。随后，能量代谢从有氧呼吸转向无氧呼吸（Gibbs等人，2011年；Voesenek等人，2016年）。还有其他一些TF也被报道在拟南芥（Arabidopsis thaliana）和其他植物中调节与无氧代谢相关的基因，如在极端缺氧条件下调节AtMYB2（Abe等人，2003年）、DkMYB6/DkERF9/19（Fang等人，2016年）和DkERF24/DkWRKY1（Zhu等人，2019年），这为了解它们的缺氧反应提供了深刻的见解。然而，在长期无氧呼吸过程中，能量不足和无氧代谢产物（如乙醇和乳酸）的过度积累会对正常细胞功能造成损害（Wright等人，2015年），并导致生理紊乱（CO?损伤）或果实异味（Ke等人，1992年；Thewes等人，2019年）。因此，植物在通过调节无氧呼吸和代谢来适应低氧胁迫方面存在局限性。

适当低O?和高CO?浓度的大气环境，如在改良气氛包装和控制气氛（CA）储存中，已被证明是在低温（LT）下延长各种水果保质期的有利条件（Ali等人，2021年；Deell和Ehsani-Moghaddam，2012年；Lum等人，2017年；Yang等人，2020年）。多项研究表明，CA条件可以在不增强无氧呼吸的情况下减轻有氧呼吸，从而维持细胞生存和品质所需的平衡能量代谢（Li等人，2018年；Saquet等人，2003年）。研究发现，在低氧气氛中，许多与非无氧代谢相关的基因（Ye等人，2024年；Zhu等人，2013年），包括某些TF（Romero等人，2016年；Wang等人，2017a），被激活，水果的质量得以保持。这些发现表明植物具有复杂的调节途径来应对低氧胁迫。了解植物在适当低氧水平下的代谢适应机制可能有助于提高其耐缺氧性，并改进CA储存技术的应用。

γ-氨基丁酸（GABA）是一种非蛋白质组成的氨基酸，在植物响应各种环境变化时迅速积累。GABA通过调节植物的C/N平衡、细胞pH值、昆虫防御、活性氧水平和能量水平来帮助抵抗胁迫（Jin等人，2019年；Rocha等人，2010年；Takayama和Ezura，2015年）。先前的研究确定了植物中生成GABA的三种途径：GABA代谢途径、脯氨酸代谢和多胺代谢（Kanwal和Incharoensakdi，2020年；Yang等人，2013年）。其中，与TCA循环密切相关的GABA代谢途径是大多数植物中GABA代谢的主要途径（Studart-Guimaraes等人，2007年；Michaeli等人，2011年）。在此途径中，谷氨酸通过谷氨酸脱羧酶（GAD）转化为GABA，GABA随后通过GABA转氨酶（GABAT）和琥珀酸半醛脱氢酶（SSADH）代谢为琥珀酸（SA），因此与TCA循环相关（Bouche和Fromm，2004年；Takayama和Ezura，2015年）。事实上，在低O?和高CO?条件下激活GABA代谢途径与改善果实品质有关，这已在多种植物物种中得到报道，例如生菜（20 kPa CO?，最初为20% CO?；Ke等人，1992年）、藤蔓成熟番茄（11 kPa O? / 9 kPa CO?，最初为11% O? / 9% CO?；Makino等人，2008年）、苹果（2.5 kPa O? / 2.0 kPa CO?；Trobacher等人，2013年）、龙眼（5 kPa O? / 10 kPa CO?，最初为5% O? / 10% CO?；Zhou等人，2016年）和新鲜带壳核桃（5 kPa O? / 7.5 kPa CO?，最初为5% O? / 7.5% CO?；Ye等人，2024年；Ye等人，2021年）。此外，对新鲜带壳核桃的组学分析显示，在CA储存期间参与GABA代谢途径和TCA循环的不同表达基因（DEGs）的表达增加。这些包括JrGAD4、JrSSADH、JrSDHs、JrMDHs和JrIDHs，以及SA、富马酸和苹果酸浓度的升高（Ye等人，2024年）。在其他植物中，也有几个与GABA合成相关的基因在低氧条件下显著上调，包括AtGAD4（5 kPa O?；Miyashita和Good，2008年）、SlGAD2/3（10 kPa CO?，最初为10% CO?；Deewatthanawong等人，2010年）和PpGAD2（watercore；Liu等人，2023年）。这些发现支持植物通过多种机制适应低氧环境的假设，并表明GABA代谢途径可能在它们对低氧条件的响应中起关键作用（非无氧）。然而，关于GABA代谢途径基因的功能知之甚少，特别是它们在低氧响应中的作用。因此，研究GABA代谢途径相关基因的转录调控将加深我们对植物适应低氧大气机制的理解。

在缺氧条件下储存的果实中，褐变是最常见的表型。这种变化用于评估植物的衰老程度或胁迫损伤，这通常发生在苹果、梨、新鲜带壳核桃和其他果实中，严重影响其商业价值（Li等人，2020a；Novillo等人，2014年；Zhu等人，2019年；Ye等人，2024年）。早期研究已经证实，维持高能量水平有助于减轻褐变（Ho等人，2013年；Li等人，2024年）。在新鲜带壳核桃中，壳的褐变与内核的质量密切相关（Wang等人，2017b；Ye等人，2024年）。这主要是因为壳起到天然屏障的作用，保护内核免受氧化损伤。然而，当壳的褐变严重时，这种保护功能失效，严重褐变的壳中的深色汁液会污染内核，显著降低其商业价值。先前的研究发现，新鲜带壳核桃能够显著适应低氧条件（3.5 kPa - 13.0 kPa O?和4.3 kPa - 7.5 kPa CO?，最初为3.5% - 13.0% O?和4.3% - 7.5% CO?）（Wang等人，2017b；Ye等人，2021年；Ye等人，2024年）。具体来说，5 kPa O? / 7.5 kPa CO?条件通过促进GABA代谢途径向TCA循环的转化，有效抑制了四种不同核桃品种的壳褐变，从而保持了核桃内核的较高品质（Ye等人，2024年）。这一发现证实了GABA代谢在低氧CA条件下缓解果实褐变的关键作用，然而其背后的分子机制仍不清楚，限制了基于低O?/高CO?储存的采后保存技术的优化和创新。基于上述研究及其发现，本研究使用新鲜带壳核桃作为实验样本，并在外源性GABA和GABA合成抑制剂的作用下结合CA条件进行处理，以分析影响核桃壳GABA代谢途径和褐变过程的关键调控靶点。同时，通过RNA测序（RNA-Seq）鉴定了对低氧CA响应的候选乙烯响应因子（ERFs），并进一步探讨了GABA代谢途径的转录调控机制。本研究阐明了ERFs在低氧CA条件下通过编码GAD的基因（JrGAD4）在转录水平上调节GABA代谢和壳褐变的潜在分子机制。结果为在果实储存和植物缺氧调节中应用CA技术提供了重要的理论基础。

部分摘要

果实材料和处理

新鲜带壳核桃（Juglans regia cv. Xifu 1）从中国西北部陕西省宝鸡市的一个十年生商业核桃园随机收获（北纬34°87′，东经106°78′），在授粉后150天（DAP），此时绿色壳已经开始变黄但尚未完全与核桃壳分离（商业成熟阶段）。核桃被运输到中国西北农林科技大学，距离采集地点约3小时。将均匀且健康的果实分成

GAD激活的GABA代谢途径在调节CA条件下核桃果实的褐变中起作用

我们之前的研究表明，在新鲜带壳核桃中，由GAD介导的GABA合成是响应5 kPa O?和7.5 kPa CO?（CA）条件下GABA代谢增强的初始指标（Ye等人，2024年）。为了阐明CA通过活跃的GAD活性调节内源性GABA合成并减轻核桃果实褐变的作用，我们测量了与GABA代谢途径相关的指标，并监测了用外源性GABA处理的新鲜带壳核桃在CA储存期间的褐变过程

适当的低O?和高CO?条件通过调节GABA合成酶GAD来促进GABA代谢并延缓核桃壳的褐变

随着极端环境的增加，植物在低氧条件下面临能量不足的挑战（Gibbs等人，2011年；Licausi等人，2011年；Luo等人，2022年）。越来越多的证据表明，植物可能会采用适应策略来应对氧气水平的逐渐下降，在极端缺氧（<1 kPa O?）和低氧（>2 kPa O?）条件下表现出不同的能量调节过程（Jethva等人，2022年；Terzoudis等人，2022年）

结论

本研究证实了GABA代谢途径在新鲜带壳核桃的CA储存过程中调节褐变的重要作用。外源性GABA处理延缓了褐变的开始，并在储存的前28天内降低了褐变指数。然而，它未能提供足够的底物来维持GAD活性（内源性GABA合成），从而加速了核桃的褐变。GAD抑制剂抑制了GABA代谢

作者贡献声明

Yuwei Wang：方法学、正式分析、数据管理。Sike Wang：写作 - 审稿与编辑、方法学。Shan Liu：可视化、方法学、数据管理。Yongqi Zhang：可视化、数据管理。Shizhe Liu：可视化、正式分析、数据管理。Guoli Dai：写作 - 审稿与编辑、方法学、正式分析。Ma Huiling：写作 - 审稿与编辑、验证、监督、资金获取、正式分析、概念化。Niu Ye：写作 - 初稿

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（项目编号：32271926）、区域自然科学基金项目（项目编号：32260411）和陕西省重点研发计划（项目编号：2024NC-YBXM-144）的支持。作者感谢Lingyu Qiu、Dongli Zhang、Mingrui Li和Miaomiao Ge在实验室工作中的积极参与。

访问编号

本文的RNA序列数据可以在NCBI数据库中找到