印度西孟加拉邦发现的寄生在拟步甲（Gonocephalum depressum Fabricius, 1801）体内的新物种Stylocephalus epistupaformis的综合性分类描述（顶复门：Eugregarinorida目）
《Protist》：Integrative taxonomic description of
Stylocephalus epistupaformis n. sp. (Apicomplexa: Eugregarinorida) parasitising the darkling beetle
Gonocephalum depressum Fabricius, 1801, in West Bengal, India
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本研究通过DIC显微镜、扫描电镜及SSU rDNA测序，首次对寄生在印度暗足甲虫（Gonocephalum depressum）中的一种钩形沟口虫（Stylocephalus epistupaformis）进行综合形态学与分子系统发育分析，确认其为新物种，并揭示了其分类地位与进化多样性。
Susobhan Mondal | Biplob Kr. Modak
印度西孟加拉邦Bankura市Sonamukhi学院动物学系，邮编722207
摘要
属Stylocephalus Ellis, 1912（Apicomplexa: Eugregarinorida）具有广泛的分布和形态多样性；然而，物种的界定传统上依赖于光学显微镜。在本研究中，利用差示干涉对比（DIC）显微镜、扫描电子显微镜（SEM）和单链区（SSU）rDNA测序技术，对一种寄生于印度西孟加拉邦Gonocephalum depressum的隔膜群居寄生虫进行了研究。滋养体（446.98–596.15 μm）呈长形，具有独特的佛塔状外层结构，以及圆柱形的中间层和基部的膨大部分；除了外层结构外，滋养体表面还分布有3–4条褶皱。配子体（562.50–856.21 μm）也呈长形，褶皱密度从每微米3–4条增加到4–4.5条。配子囊大致呈圆形（178.51–219.73 μm），表面有乳突，并通过破裂方式开裂。卵囊（9.78–12.61 × 8.10–10.40 μm）呈卵圆形且表面光滑。基于SSU rDNA的系统发育分析将该物种归入Stylocephaloidea类群，形成了一个得到强有力支持的支系（PP = 1；BP = 100），证实Stylocephalus epistupaformis为新物种。本研究通过结合光学显微镜、SEM和分子系统发育方法，填补了隔膜群居寄生虫研究中的关键空白，为Stylocephalus属提供了首个综合性的描述。同时，本文还概述并强调了该属的多样性和分类学问题。
引言
Apicomplexa门是单细胞寄生虫中最为多样化和进化意义最为重要的类群之一，包含了具有医学重要性的物种以及能够揭示寄生现象和细胞极性起源的早期分化谱系（Desportes和Srével, 2013）。其中，群居寄生虫构成了该门中研究宿主-寄生虫相互作用的关键群体。它们广泛分布于无脊椎动物和尾索动物中，寄生于消化道、体腔、Malpighian管和生殖囊中，并展现出适应宿主附着和营养获取的显著形态特征（Chen等, 1997; Field和Michiels, 2006; Valigurová和Koudela, 2006）。
在Eugregarinida目中，隔膜群居寄生虫是形态最为复杂且分类学上最多样化的谱系之一，尤其是那些与暗甲虫（Coleoptera: Tenebrionidae）相关的种类。Stylocephalidae Ellis, 1912科的成员，尤其是Stylocephalus和Xiphocephalus属，是报道最频繁的暗甲虫寄生虫（Clopton, 1999; Haldar等, 2004）。Stylocephalus Ellis, 1912属目前包含超过30个有效物种，分布于新北界、古北界、埃塞俄比亚界和东洋界（Desportes和Srével, 2013）。该属的特征是具有长形的外层结构，其末端为球形或锥形，基部或近顶端有膨大部分，中间层为长圆柱形。配子囊表面覆盖有乳突并含有残留物（伪囊），卵囊呈钱包状，通常以长链形式释放（Clopton, 2002）。
尽管这类寄生虫分布广泛，但由于其在经济和医学上的重要性有限，其分类学和多样性仍知之甚少。迄今为止，全球已记录了约3124种无脊椎动物中的群居寄生虫（Levine, 1988）。虽然大多数Eugregarinida物种来自昆虫，但这仅占所有已命名昆虫物种的不到0.32%（Levine, 1988）。同样，在已描述的甲虫物种中，群居寄生虫的比例也低于0.31%（Borror等, 1981; Levine, 1988）。此外，大多数物种描述仅依赖于光学显微镜，仅有少数隔膜群居寄生虫通过电子显微镜或分子系统发育方法进行了研究（Perkins等, 2000; Simdyanov等, 2017）。在Stylocephalus属中，仅有两个物种经过基因鉴定，且均未进行超微结构研究，因此东洋地区的分类地位仍不清楚。
本研究旨在通过提供首个结合光学显微镜、SEM和分子系统发育方法的综合描述，来填补这些空白，研究对象是寄生于印度西孟加拉邦Gonocephalum depressum（Fabricius）的Stylocephalus物种。本研究还旨在评估该物种在Stylocephalidae科中的分子独特性，并探索其生物地理亲缘关系。通过整合形态学、超微结构和分子证据，本研究为早期分支的Apicomplexa类群中隔膜群居寄生虫的进化多样化提供了重要见解。
研究区域
本研究在印度西孟加拉邦西部高原地区的草原上采集了81只成年Gonocephalum depressum Fabricius（n = 81）。样本来自以下地点：Bankura的Durgapur大坝附近（23°28′13″N 87°17′37″E）；Bankura的Beliatore（23°19′13″N 87°13′06″E）；以及Purulia的Bhabanipur（23°21′03″N 86°29′08″E）。
样本采集
样本采集在早晨或日落前几小时进行，此时甲虫最为活跃。
结果
在印度西孟加拉邦西部高原地区对寄生于暗甲虫的隔膜群居寄生虫的研究中，发现32%（26/81）的成年Gonocephalum depressum Fabricius, 1801受到感染。现代显微技术和系统发育分析揭示了其详细的形态和分类学特征。
讨论
新发现的隔膜群居寄生虫的整体形态与其他属于Stylocephalus Ellis, 1912属的物种非常相似，特征包括长形的外层结构、末端佛塔状的外层结构、基部的膨大部分、长圆柱形的中间层、表面有乳突的配子囊以及以长链形式释放的卵囊。基于SSU rDNA的系统发育分析进一步证实了这些特征。
分类学总结
(Apicomplexa: Conoidasida: Eugregarinorida: Stylocephalidae)
属： Stylocephalus Ellis, 1912
物种： Stylocephalus epistupaformis 新物种
宿主类型： Gonocephalum depressum Fabricius, 1801（Coleoptera: Tenebrionidae）
感染部位： 宿主肠道的中段
类型地点：
印度西孟加拉邦Bankura（23°28′13″N 87°17′37″E）类型材料：
印度SKBU：G1C2011（正模标本）；G1C2012（副模标本）；G1C2013（全基因型标本）
代表性DNA序列：
GenBank登录号PV791724（SSU)
结论
所描述的物种具有独特的外层结构，末端呈卵圆形，基部为圆形凸起，这种形态和测量特征与所有已知同属物种均不同。基于SSU rDNA的分子系统发育分析将该物种牢固地置于Stylocephaloidea类群中，并突显了其独特性。全面的形态学和分子分析支持了Stylocephalus
的命名。
CRediT作者贡献声明
Susobhan Mondal： 草稿撰写、可视化处理、验证、方法设计、实验实施、数据分析。
Biplob Kr. Modak： 文稿审阅与编辑、验证、监督、资源提供、方法设计、实验实施、概念构思。
资助
本研究的资金支持来自印度西孟加拉邦Bankura的Sonamukhi学院（项目编号C44762/CRG/2023–24/ZOOLOGY/SBM/1）。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
作者衷心感谢Purulia的Sidho-Kanho-Birsha大学和Santiniketan的Visva-Bharati大学的动物学系及生物技术系提供的基础设施支持。同时，也非常感谢DST-FIST项目[编号SR/FST-LSI/2018/173(c)，日期2019年9月18日]的支持。作者还感谢印度西孟加拉邦Bankura的Sonamukhi学院提供的财务支持。
