IFNγ预处理可以增强癌细胞与免疫细胞之间的相互作用。A图为示意图…… 开放获取（Open Access）

《Cancer Research Communications》：IFNγ pretreatment enhances cancer–immune cell interactions. A, A schemati... Open Access

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摘要

高级别子宫内膜癌（HGEC）在非洲裔女性中发病率较高，并且常常对现有的免疫疗法具有抗性。由于缺乏能够保持祖先多样性以及患者特异性肿瘤-免疫相互作用的临床前模型，导致这种抗性机制的界定受到阻碍，同时这些模型还可能受到同种异体反应性的干扰。为了解决这一问题，我们建立了一个包含85个来自不同患者群体的子宫内膜癌类器官（PDO）的生物库，其中富含非裔美国患者的HGEC类器官，并将这些类器官与患者自身的免疫细胞配对，开发了一个具有实时活体成像功能的患者特异性PDO-免疫细胞共培养平台。利用该系统，我们发现HGEC通过显著抑制主要组织相容性复合体（MHC）I类和II类抗原呈递途径来逃避免疫监视。通过IFNγ刺激或通过增强子Zeste同源物2的抑制进行表观遗传重编程，可以恢复抗原呈递，从而使HGEC类器官对自体T细胞介导的细胞毒性敏感。将该平台扩展到NK细胞后，发现其对低MHC-I表达的类器官具有更强的杀伤作用。与临床观察结果一致，MMR缺陷的HGEC类器官表现出比MMR正常的类器官更强的免疫反应。最后，该平台还用于评估新兴免疫疗法的安全性和有效性，包括蛋白酶激活的双特异性T细胞结合剂和EGFR靶向的嵌合抗原受体T细胞。总体而言，这一可持续、可扩展且具有祖先多样性的自体PDO-免疫细胞共培养平台为解析免疫逃逸机制和加速开发新的子宫内膜癌治疗方法提供了有力工具。

意义：目前免疫疗法对HGEC的有效性仍然有限，部分原因是现有的临床前模型无法充分反映肿瘤异质性和患者特异性的免疫微环境。尽管癌症研究在其他类型癌症（如乳腺癌和卵巢癌）中取得了进展，降低了死亡率，但子宫内膜癌的死亡率却有所上升，这凸显了迫切需要改进治疗策略的必要性。子宫内膜癌主要分为两种类型：I型通常为低级别、雌激素依赖型，与肥胖和长期雌激素暴露有关；II型或高级别子宫内膜癌（HGEC）更具侵袭性，包括浆液性癌和肉瘤样癌等亚型。值得注意的是，HGEC在非洲裔女性中的发病率较高，且预后较差，这突显了子宫内膜癌发病率和预后方面的种族差异。目前HGEC的主要治疗方法是手术切除，随后根据疾病阶段进行辅助化疗和放疗，但这些标准治疗方案对HGEC的效果并不理想，因为HGEC具有异质性和高复发率。免疫检查点抑制剂的引入与化疗联合使用为HGEC患者带来了新的希望，最初在MMR缺陷（MMRd）肿瘤中显示出疗效。最近，美国食品药品监督管理局（FDA）将这种联合疗法的适应症扩展到了晚期或复发性子宫内膜癌，不论其MMR状态如何。尽管取得了这些进展，但在有效治疗HGEC方面仍存在重大挑战，因此需要开发更有效的治疗策略。临床前模型是理解肿瘤生物学和测试新疗法的重要工具。先前的研究已经阐明了子宫内膜癌的分子特征，并且已经努力建立了包括患者来源的异种移植和类器官培养在内的癌症模型。患者来源的类器官（PDO）模型是从患者肿瘤中提取的三维培养物，为再现原始肿瘤的组织学和遗传特征提供了有希望的途径。然而，现有的PDO模型往往缺乏免疫微环境，限制了它们在研究肿瘤-免疫相互作用和免疫疗法反应方面的应用。此外，能够准确代表来自不同患者群体的HGEC亚型的临床前模型非常有限，尤其是在受HGEC影响较大的非洲裔女性中。整合了同一患者来源的癌细胞和免疫细胞的自体模型对于复制个体肿瘤的特定细胞动态和分子特征至关重要。这些模型有助于深入研究肿瘤-免疫相互作用并评估新的免疫疗法方法。尽管最近已经为其他类型的癌症开发了自体癌症-免疫细胞共培养系统，但尚未为HGEC建立此类模型。为了提高免疫疗法对HGEC的有效性并解决现有的差异，迫切需要为不同祖先背景的患者建立HGEC的自体模型。一些研究描述了妇科癌症的免疫学方面，如抗原呈递途径的改变以及肿瘤浸润淋巴细胞与肿瘤MMR状态之间的关联。然而，由于缺乏来自临床前子宫内膜癌模型的数据，相关机制研究仍然有限。虽然有一些长期建立的细胞系被用于特征分析和机制研究，但这些细胞系无法完全再现患者的临床和分子特征。此外，某些类型的HGEC缺乏相应的细胞系。此外，使用这些细胞系研究癌症-免疫细胞相互作用时，同种异体反应性是一个显著限制。在这项研究中，我们为不同祖先背景的HGEC患者建立了自体PDO-免疫细胞共培养平台，该平台能够在个体患者水平上研究癌症-免疫相互作用，并为开发和测试新的免疫疗法提供个性化方法。通过结合自体免疫微环境并涵盖不同祖先背景的样本，我们的模型和资源在推进对HGEC生物学的理解以及改善治疗结果方面具有巨大潜力。

材料与方法

人类样本收集

本研究获得了Northwell Health机构审查委员会（IRB #18-0897）的批准。所有参与者均提供了书面知情同意书，所有程序均遵循公认的伦理指南。肿瘤和匹配的非恶性子宫内膜组织是从因良性或恶性原因接受子宫切除术的同一患者中收集的，样本来自Long Island Jewish Medical Center。每位患者在手术时也采集了匹配的外周血。所有手术切除工作由妇科肿瘤科完成。纳入研究的患者在手术前均通过子宫内膜活检或刮宫术进行了子宫内膜癌的评估。患者的年龄范围为30至85岁（平均63.8岁；标准差13.0岁）。原发肿瘤的MMR状态通过免疫组化（IHC）检测MLH1、MSH2、MSH6和PMS2来确定，由Long Island Jewish Medical Center的认证病理学家进行解读。由于本研究专注于女性患者的子宫内膜癌，因此未考虑性别这一生物学变量。由于我们队列中的祖先分布与肿瘤类型/亚型相关，且每种祖先的样本量有限，因此未进行祖先分层的统计比较。

祖先比例的确定使用ADMIXTURE v1.3.0软件（RRID: SCR_001263；参考文献20），该软件采用最大似然法估计样本中参考人群祖先的比例。样本的基因分型使用GATK pileup（RRID: SCR_001876）直接在样本上生成了1,964个无关的1000 Genomes项目样本的基因型数据，阈值设为0.6。在基于RNA测序（RNA-seq）的遗传祖先估计中，排除了来自洛杉矶的墨西哥裔、巴巴多斯的非洲加勒比裔以及美国西南部的非洲裔参考个体，因为这些人群被认为高度混合。然而，没有根据患者自报的祖先信息排除任何样本。进一步使用PLINK v1.9（RRID: SCR_001757；参考文献21）对参考个体进行筛选，该软件设置了最小等位基因频率为0.01（总体）和至少在一个1000 Genomes超级群体中为0.05的阈值。此外，使用PLINK v1.9还对变异进行了连锁不平衡修剪，窗口大小为500 kb，步长为250 kb，r2阈值为0.2。分析结果将每个样本按比例分为五个大陆人群[非洲（AFR）、混合美洲（AMR）、东亚（EAS）、欧洲（EUR）和南亚（SAS）以及23个其他人群。

类器官的生成与培养

类器官的制备和维持方法如前所述（23-25）。简而言之，子宫内膜组织被切碎至直径约1毫米，然后用PBS洗涤两次。组织样本在含有10 μmol/L Y-27632二盐酸盐（Tocris，1254）的胶原酶IV（Sigma-Aldrich，C9407）中消化2至3小时。随后在含有Y-27632二盐酸盐的TrypLE Express（Thermo Fisher Scientific，12604）中孵育10至20分钟，并通过显微镜确认细胞是否为单个细胞。消化过程用Advanced DMEM F-12（Gibco，12634028）终止，离心后，将样本重新悬浮在70% Matrigel（Corning，356234）和30%相应培养基（23）中，并接种在预热的培养板上。培养基每3天更新一次。根据生长情况，类器官每10至20天进行分株。分株时，使用Cell Recovery Solution（Corning，354253）处理类器官30分钟，然后用含有Y-Factor的TrypLE消化10至20分钟。消化过程用Advanced DMEM F-12终止，离心后，将单个细胞接种到每10 μL含有5,000个细胞的密度上。

药物治疗

如上所述，准备共培养时将已建立的类器官分株，并让其生长2至3天。然后分别用2 ng/mL IFNγ（Peprotech，300-02）或0.5 nmol/L tazemetostat（TAZ；Selleckchem，S7128）预处理类器官2天，之后进行RT-qPCR或流式细胞术分析。对于TAZ处理，培养基每2天更新一次。

免疫组化和免疫荧光染色

组织或类器官的处理方法如前所述（23）。简而言之，组织和类器官先用10%甲醛固定，然后包埋在石蜡中并切片。抗原提取使用柠檬酸缓冲液（Sigma-Aldrich，C9999）按照制造商的协议进行。后续的IHC使用IHC试剂盒（Vector laboratory，30130）和一抗（补充表S2）进行。切片再用苏木精进行复染。对于免疫荧光（IF）染色，切片与结合了荧光分子的二抗（补充表S2）孵育，然后用PBS洗涤三次。荧光显微镜成像。

单分子原位杂交

使用Advanced Cell Diagnostics RNAscope 2.5 HD Detection Kit（475891）按照制造商的协议进行主要组织相容性复合体（MHC）-II（HLA-DRA）的单分子原位杂交。

外周血单核细胞的分离

使用SepMate-15 Kit（Stem Cell Technology，85415）按照制造商的协议从患者血液样本中分离外周血单核细胞（PBMC）。简而言之，全血样本以1:1的比例与PBS + 2% FBS稀释后，小心倒入装有Lymphoprep溶液（Stem Cell Technology，85415）的15-mL管中。然后将管子在1,200 × g下离心15分钟，上层液体转移到新的15-mL管中，再以300 × g离心3分钟。沉淀物用PBS + 2% FBS洗涤，并按照制造商的协议用冷冻介质（Gibco，12648010）冷冻保存。

解冻冷冻的自体PBMC

将冷冻的自体PBMC解冻至37°C，离心后重新悬浮在含有hIL2（R&D Systems，202-IL-010）和hIL7（R&D Systems，207-IL-010）的人类T细胞培养基中，浓度为1 × 10^6细胞/mL。培养基每3天更换一次，直至使用完毕。

T细胞和NK细胞的分离

对于T细胞亚型检测，首先使用CD3-CD28抗体按照制造商的协议（Stem Cell Technology，10971）扩增PBMC。简而言之，PBMC在含有CD3-CD28抗体的培养基中以25 μL/1 × 10^6 PBMC的浓度刺激3天。激活剂随后被清洗掉，PBMCs（外周血单核细胞）被进一步培养了2周。当进入生长停滞期后，根据制造商的协议，使用EasySep Human CD8+ T-cell（Stem Cell Technology，17953）和CD4+ T-cell（Stem Cell Technology，19852）分离试剂盒从扩增的T细胞中分离出CD8+和CD4+ T细胞。NK细胞则使用EasySep Human NK Isolation Kit（Stem Cell Technology，17955）从健康捐赠者的PBMCs中分离出来。分离出的免疫细胞亚型（CD8+、CD4+和NK细胞）立即用于共培养实验。

在准备共培养时，PDO细胞按照上述方法进行分裂，并允许其生长2到3天。然后，在不同的实验中，PDO细胞分别用2 ng/mL的IFNγ（Peprotech，300-02）预刺激2天（第4-5天）或用0.5 nmol/L的TAZ（Selleckchem，S7128）刺激10天（第12-13天）。接着，PDO细胞用1 μmol/L的Cell Tracker Red（Thermo Fisher Scientific，C34552）染色，免疫细胞用1 μmol/L的Cell Tracker Green（Thermo Fisher Scientific，C7025）染色30分钟。之后，细胞用相应的培养基清洗两次。免疫细胞（200,000个细胞）直接与PDO细胞（50-100个PDO细胞；大约1:10的效应细胞与靶细胞比例）混合，在45%的类器官培养基/45%的人T细胞培养基和10%的Matrigel中，加入500 nmol/L的caspase-3/7染料（Sigma-Aldrich，SCT104），然后接种到96孔成像板的各个孔中（Agilent，204626-100）。然后将板短暂离心（100 g，1分钟）以使细胞均匀分布。除非另有说明，否则在第二天对接种的共培养样本进行成像，以评估癌细胞与免疫细胞的相互作用以及类器官的凋亡情况。所有免疫细胞亚型（PBMCs、CD8+、CD4+和NK细胞以及未转导/转导了EGFR嵌合抗原受体（CAR）的T细胞）都使用相同的人T细胞培养基。

与上述共培养设置类似，在最后一次离心之前，先准备好免疫细胞和PDO细胞。然后，在96孔成像板的相应孔中加入100 nmol/L的双特异性结合剂（包括不可切割的matriptase、尿激酶原激活剂uPA和cathepsin B（CTSB）的重链和轻链），并短暂离心。之后，在短暂的恢复时间（3小时）后对接种的共培养样本进行成像。

与上述共培养设置类似，首先准备好免疫细胞和PDO细胞。接着，在96孔成像板的相应孔中加入100 nmol/L的双特异性结合剂的重链和轻链，然后短暂离心。之后，在短暂的恢复时间（3小时）后对接种的共培养样本进行成像。

与上述共培养设置类似，首先准备好PDO细胞、EGFR-CAR-T细胞和未经改造的同种异体CD8+ T细胞。由于免疫细胞的数量有限，免疫细胞（100,000个）和PDO细胞（25-50个）的数量都进行了调整。然后在第二天对接种的共培养样本进行成像。

所有的成像都是使用Perkin-Elmer UltraVIEW VoX系统完成的，成像时间在图中和图例中有所标注。该系统配备了一个高速旋转盘（Yokogawa CSU-X1）激光共聚焦显微镜，具有出色的活细胞成像能力、光动力单元（FRAP，光激活功能）、六种激光波长（405、440、488、514、561和640 nm）、高端CCD相机以及全自动样品台。分析使用Volocity版本6.3（RRID: SCR_002668）进行。首先，通过最大强度投影处理Z-stack图像以供后续分析。通过将图像与明场图像进行比较，为每种荧光蛋白设置阈值以检测来自相应目标的阳性信号（例如PDO细胞、免疫细胞和caspase-3/7）。然后生成每个时间点的共定位系数值（26），表示共定位荧光蛋白与总荧光蛋白的比例。这些值随后被导出到MS Excel中进行进一步分析。为了量化癌细胞与免疫细胞的相互作用，将每个时间点的免疫细胞共定位系数（Immuneco-loc/Immunetotal）标准化到初始时间点（t = 0）的系数值，在该时间点PDO细胞和免疫细胞在孔中均匀分布。这种标准化是为了消除非相互作用细胞（即PDO细胞和免疫细胞只是简单堆叠在一起）导致的假阳性结果。然后将标准化后的值绘制在共培养的时间进程中。对于caspase-3/7的共定位系数值，首先将PDO细胞与caspase-3/7共定位的比例（Organoidco-loc/Organoidtotal）标准化到相应时间点的非免疫细胞组的系数值，以排除非免疫细胞介导的caspase-3/7活性（例如由饥饿引起的活性）。然后，将完全凋亡与不完全凋亡的比例乘以系数值，以量化最终时间点免疫细胞介导的类器官凋亡的程度。从每个条件的三个孔中获取多张图像的数据进行统计分析。

PDO细胞收集在Cell Recovery Solution（Corning）中，其RNA使用Trizol试剂（Thermo Fisher Scientific，15596026）提取。根据制造商的说明，使用Zymogen Direct-zol RNA试剂盒（Zymo Research，R2062）从PDO细胞中提取RNA。RNA的耗竭和文库制备使用NEBNext? Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina（Illumina，E7765S/L）按照制造商的协议进行。制备好的文库使用Agilent Bioanalyzer 2100和高灵敏度DNA芯片（Agilent，5067-4626）进行分析。测序使用NextSeq500完成。索引修剪后的单端75个碱基对的读段使用Hisat2（v2.1.0；RRID: SCR_015530）与人类参考基因组对齐，生成BAM文件。使用featureCounts从BAM文件中总结基因水平计数矩阵。计数矩阵导入R Bioconductor（RRID: SCR_006442）和DESeq2包（RRID: SCR_000154）进行差异基因表达分析，假发现率<0.1。然后使用R包的heat-map功能进行热图生成，并应用缩放和聚类分析。

正常和HGEC PDO细胞被接种在Matrigel和相应的培养基中1天。第二天，将培养基替换为含有20 μg DQ-ovalbumin（DQ-ova）或等体积PBS（Thermo Fisher Scientific，D12053）的培养基，并在37°C下孵育16小时。之后收集细胞并进行流式细胞术分析。

PDO细胞收集在Cell Recovery Solution（Corning）中30分钟，然后按照上述方法用TrypLE（Gibco）和Y-27632二氢氯化物消化，直到它们变成单细胞。之后用1:200稀释的抗体（见补充表S2）染色30分钟，再用PBS + 2% FBS清洗。制备好的样本通过40-μm滤网过滤，使用BD LSRFortessa进行流式细胞术分析。

对于qPCR分析，PDO细胞用Trizol裂解，然后使用ZymoResearch RNA分离试剂盒根据制造商的协议提取RNA。接着使用cDNA合成试剂盒（SuperScript IV VILO MasterMix，Invitrogen，11756050）将RNA转化为cDNA。使用TaqMan Gene Expression Assay（Thermo Fisher Scientific，见补充表S2）进行qRT-PCR。PCR反应重复进行两次。目标基因的表达水平相对于HSP90进行标准化，并计算相对表达量。通过将实验组的相对表达量与对照组进行比较来计算目标基因的相对表达倍数。

对于Western blot分析，从处理过或未处理的HGEC PDO细胞中提取变性蛋白质（20 μg），使用NuPAGE凝胶（Thermo Fisher Scientific，NP0322BOX）分离，并转移到聚偏二氟乙烯膜（Thermo Fisher Scientific，88518）上。膜在室温下用5%的非脂牛奶在PBST中封闭1小时，然后在4°C下与识别总组蛋白H3的兔单克隆抗体（mAb，Cell Signaling Technology，4499，克隆：D1H2，RRID: AB_10544537，见补充表S2）或识别H3K27me3的兔mAb（Cell Signaling Technology，9733，克隆：C36B11，RRID: AB_2616029，稀释度1:1,000，见补充表S2）孵育过夜。用PBST清洗后，膜与二级抗体（驴抗兔抗体，Invitrogen，A32790，RRID: AB_2762833，稀释度1:20,000，见补充表S2）孵育。再次用PBST清洗膜，然后使用Licor Odyssey Western blot imager检测蛋白质条带。总组蛋白H3用作等量加载对照。使用Image J软件（RRID: SCR_003070）量化条带密度。

除非另有说明，所有实验都重复进行三次。所有数据均表示为平均值±标准误差（SEM）。统计显著性定义为P < 0.05。对于两组之间的统计差异，使用Student t检验。对于未配对的样本，使用单因素或双因素ANOVA进行分析。对于配对的样本，使用配对t检验。所有统计分析均使用GraphPad Prism版本8.4.3（RRID: SCR_002798）进行。

一个祖先多样化的PDO生物库揭示了HGEC中抗原呈递的减弱

为了确定我们子宫内膜癌患者群体的祖先组成，我们首先对来自44名患者的85个PDO细胞进行了基于RNA的祖先预测（20），这些患者涵盖了各种子宫内膜癌亚型（图1A和B；补充图S1A）。与先前的研究一致，这些患者中大多数HGEC PDO细胞来自非洲裔患者（16/27；补充表S1）。此外，我们队列中的体重指数和微卫星稳定性状态的分布也与已有的研究结果一致（27, 28）。我们还观察到不同种族群体之间的MMR突变状态没有显著差异（补充图S1B），这与先前的报告一致（29, 30）。图1。

在HGEC类器官中，抗原呈递和加工过程受到下调。A，实验中使用的子宫内膜癌（EC）PDO细胞的基于RNA的祖先估计（n = 50）。B，根据肿瘤级别分类的实验中使用的EC PDO细胞的基于RNA的祖先估计。C，条形图显示子宫内膜癌患者的微卫星稳定性状态（n = 50）及其相关的BMI（癌症；n = 50，良性；n = 8）。MSI表示微卫星不稳定性；MSS表示微卫星稳定性。D，使用配对的EC PDO细胞线生成的RNA-seq数据的热图（低级别；n = 4，高级别；n = 7，正常；n = 11）。E， violin图显示HGEC（上图，红色）和LGEC（下图，蓝色）PDO细胞及其匹配的正常对照中的MHC-II基因。F，通过RT-PCR分析匹配的正常和HGEC PDO细胞中的稳态MHC-I、-II基因和PD-L1 mRNA表达水平（每个组n = 10）。每个点代表目标基因的相对mRNA量，相对于来自单个PDO细胞的参考基因HSP90A进行标准化。G，通过流式细胞术测量的EC PDO细胞在稳态下的免疫调节蛋白表达水平的平均荧光强度（MFI）（正常；n = 7，高级别；n = 9）。使用普通单因素ANOVA（F和G）计算统计显著性（*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001）。

肿瘤通过重新编程其微环境来抑制免疫监视，阻止参与肿瘤清除的免疫细胞（如T细胞）的激活。这种免疫逃逸的一个关键机制是下调MHC分子，这些分子对于抗原呈递和随后的T细胞激活至关重要（31）。我们对PDOs进行了批量RNA-seq分析，包括来自非洲血统的HGEC PDOs，以研究参与抗原呈递和加工途径的基因表达（补充图S1C）。这些分析显示，在正常子宫内膜组织、低级别子宫内膜癌（LGEC）和HGEC PDOs中，MHC I类（HLA-A/B、B2M、NLRC5、TAPBP和PDIA3）、MHC II类（HLA-DQ、-DM、-DR、-DO、CD74、CIITA和CTSB）以及免疫蛋白酶体（PSMB、PSME和HHLA）组分的表达水平存在差异。鉴于HGECs观察到的异质性，我们专注于匹配的正常组织与肿瘤PDOs进行更直接的比较。我们注意到免疫调节基因的表达减少（图1D），包括HGEC PDOs中关键MHC II类基因如CIITA和HLA-DOB的下调，这种模式在LGEC PDOs中未观察到（图1E），以及其他参与MHC-II表达的基因（补充图S1D）。为了验证这些发现，我们对来自更大队列的匹配正常/良性及子宫内膜癌PDO对进行了RT-qPCR，测量了个体患者水平的MHC I类和II类基因表达。在LGEC PDOs（4例欧洲人和6例非洲人）中，MHC I类和II类基因的表达水平与其匹配的正常PDOs相当（补充图S1E）。相比之下，HGEC PDOs（1例欧洲人和9例非洲人）的MHC I类和II类基因表达显著降低，这证实了RNA-seq的结果（图1F）。先前的研究，包括我们自己的研究，已经报告了MHC-II途径基因在肿瘤进展过程中的下调（32）。为了进一步评估MHC-II途径在HGEC中是否在蛋白质水平上受到抑制，我们进行了流式细胞术分析。与RNA水平一致，HGEC PDOs中的MHC II类蛋白质水平明显低于匹配的正常对照组（图1G），而在LGEC PDOs中未观察到这种效应（2例欧洲人和1例混合血统；补充图S1F）。使用单分子原位杂交技术，我们发现原发性HGEC组织及其对应的PDOs中的MHC-II表达减弱（补充图S1G；非洲血统）。接下来，我们评估了MHC II类途径基因的下调是否影响了HGEC PDOs处理细胞外抗原的功能能力。我们用DQ-ova培养了HGEC和正常对照PDOs，DQ-ova是一种在蛋白水解时发出荧光的白蛋白结合物，用作MHC-II途径抗原处理的代理（33, 34）。HGEC PDOs（6例非洲人）处理DQ-ova的能力显著降低，与正常对照组相比（补充图S1H），包括在一个匹配的肿瘤-正常对中（补充图S1I）。总体而言，这些发现表明HGEC PDOs中的基因表达水平和抗原呈递途径的功能能力均有所下降，这可能有助于解释HGECs中经常观察到的免疫逃逸现象。我们建立了一个自体PDO–免疫细胞共培养平台来测试免疫调节干预措施。

IFNγ信号调节上皮细胞和癌细胞中MHC-I和MHC-II抗原呈递途径的表达（32, 35）。传统上，IFNγ被认为具有抗肿瘤作用，因为它可以上调MHC，但越来越多的研究表明，长期暴露于IFNγ可能会通过上调癌细胞中的免疫调节分子（如PD-L1）而具有促肿瘤作用（36, 37）。此外，IFNγ驱动的MHC-II上调可能会根据特定的肿瘤微环境（TME；参考文献32, 35）增强或抑制免疫反应，其在HGEC中的意义尚不清楚。为了研究HGEC PDOs对IFNγ的反应性，我们用IFNγ刺激了HGEC和正常PDOs，并观察到MHC-I和MHC-II mRNA（补充图S2A；肿瘤：9例非洲人，正常：2例欧洲人，1例南亚人和1例美洲原住民）以及蛋白质（补充图S2B；肿瘤：11例非洲人，正常：1例非洲人，3例欧洲人，2例南亚人，1例美洲原住民和1例无数据）水平的显著增加。接下来，为了确定IFNγ信号和IFNγ诱导的抗原呈递如何影响HGEC的免疫监视，我们开发了一个带有活细胞成像的共培养平台，以精确追踪癌细胞与免疫细胞的相互作用以及免疫细胞介导的肿瘤细胞死亡（图2A）。在这个系统中，癌细胞用红色荧光染料标记，免疫细胞用绿色荧光染料标记；它们的共定位通过共聚焦显微镜随时间进行监测。此外，我们使用活细胞成像染料实时测量了caspase-3/7酶活性的免疫介导的凋亡。我们首先使用异体PBMCs、CD8+ T细胞和CD4+ T细胞验证了我们的方法。尽管单独的IFNγ预处理并未在HGEC PDOs中诱导凋亡（图2B），但它显著促进了免疫细胞向癌细胞的迁移，从而增强了异体的免疫介导的细胞毒性（补充图S3A–S3C）。基于这些发现，我们接着评估了IFNγ刺激如何影响来自同一患者的自体免疫细胞对HGEC PDOs的免疫监视。虽然自体PBMCs与未经处理的HGEC PDOs相互作用，但并未引发任何显著的细胞毒性，这与HGEC的免疫逃逸特性一致。值得注意的是，IFNγ预处理增加了自体PBMCs、CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的迁移和细胞毒性。免疫细胞共定位分析表明，即使在未经处理的对照组中免疫细胞随时间与PDOs相互作用，但在IFNγ刺激的培养中这种效应显著增强（图2C–E）。使用额外的自体PDO–免疫细胞对也获得了类似的结果（补充图S3D和S3E）。总体而言，这些原理验证数据表明，HGEC PDOs中的基因表达水平和抗原呈递途径的功能能力均有所下降，这可能有助于解释HGECs中频繁观察到的免疫逃逸现象。我们建立了一个自体PDO–免疫细胞共培养平台来测试免疫调节干预措施。

IFNγ信号调节上皮细胞和癌细胞中MHC-I和MHC-II抗原呈递途径的表达（32, 35）。传统上，IFNγ被认为具有抗肿瘤作用，因为它可以上调MHC，但越来越多的研究表明，长期暴露于IFNγ可能会通过上调癌细胞中的免疫调节分子（如PD-L1）而具有促肿瘤作用（36, 37）。此外，IFNγ驱动的MHC-II上调可能会根据特定的肿瘤微环境（TME；参考文献32, 35）增强或抑制免疫反应，其在HGEC中的重要性仍不清楚。为了研究HGEC PDOs对IFNγ的反应性，我们用IFNγ刺激了HGEC和正常PDOs，并观察到MHC-I和MHC-II mRNA（补充图S2A；肿瘤：9例非洲人，正常：2例欧洲人，1例南亚人和1例美洲原住民）以及蛋白质（补充图S2B；肿瘤：11例非洲人，正常：1例非洲人，3例欧洲人，2例南亚人，1例美洲原住民和1例无数据）水平的显著增加。接下来，为了确定IFNγ信号和IFNγ诱导的抗原呈递如何影响HGEC的免疫监视，我们开发了一个带有活细胞成像的共培养平台，以精确追踪癌细胞与免疫细胞的相互作用以及免疫细胞介导的肿瘤细胞死亡（图2A）。在这个系统中，癌细胞用红色荧光染料标记，免疫细胞用绿色荧光染料标记；它们的共定位通过共聚焦显微镜随时间进行监测。此外，我们使用活细胞成像染料实时测量了caspase-3/7酶活性的免疫介导的凋亡。我们首先使用异体PBMCs、CD8+ T细胞和CD4+ T细胞验证了我们的方法。尽管单独的IFNγ预处理并未在HGEC PDOs中诱导凋亡（图2B），但它显著促进了免疫细胞向癌细胞的迁移，从而增强了异体的免疫介导的细胞毒性（补充图S3A–S3C）。基于这些发现，我们接着评估了IFNγ刺激如何影响来自同一患者的自体免疫细胞对HGEC PDOs的免疫监视。虽然自体PBMCs与未经处理的HGEC PDOs相互作用，但并未引发任何显著的细胞毒性，这与HGEC的免疫逃逸特性一致。值得注意的是，IFNγ预处理增加了自体PBMCs、CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的迁移和细胞毒性。免疫细胞共定位分析表明，即使在未经处理的对照组中免疫细胞随时间与PDOs相互作用，但在IFNγ刺激的培养中这种效应显著增强（图2C–E）。使用其他自体PDO–免疫细胞对也获得了类似的结果（补充图S3D和S3E）。总体而言，这些原理验证数据表明，通过IFNγ预处理增强HGEC PDOs中的抗原呈递可以加强癌细胞与免疫细胞的相互作用，并增强自体PBMCs、CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的免疫介导的细胞毒性。图2。查看大图下载幻灯片。

IFNγ预处理增强了癌细胞与免疫细胞的相互作用。A，示意图展示了类器官–免疫细胞共培养的实验流程。EC，子宫内膜癌。B，未处理组和IFNγ处理组（无免疫细胞）在终点（86小时）的PDOs与caspase-3/7信号的原始共定位系数。C，使用有无IFNγ预处理的HGEC PDO以及自体PBMC、CD8和CD4 T细胞的共培养代表图像。红色和绿色荧光分别代表子宫内膜类器官和相应的免疫细胞。蓝色荧光代表活跃的caspase-3信号。刻度尺，70 μm。D，成像过程中PDOs与免疫细胞的共定位。共定位系数（R1）按照先前的方法计算（26）并归一化到初始时间点。曲线下面积用于统计显著性（普通t检验）。E，通过类器官与caspase-3信号之间的共定位系数测量共培养中PDOs的终点存活率。共定位系数按照先前的方法计算（26）并归一化到无免疫细胞对照（载体）。Cas3，caspase-3。使用普通单因素ANOVA（E）计算统计显著性（**，P < 0.01；***，P < 0.001；****，P < 0.0001）。图2。查看大图下载幻灯片。

自体PDO–免疫细胞共培养系统用于评估具有免疫调节潜力的小分子药物的治疗意义。

由于IFNγ处理恢复了HGEC PDOs中的MHC表达，这一恢复表明MHC抑制不仅仅是由于基因改变，还可能是由可逆的表观遗传机制驱动的。实际上，肿瘤抑制途径在各种癌症中经常通过组蛋白修饰而被沉默（38）。具体来说，组蛋白甲基转移酶EZH2——催化H3K27的三甲基化（H3K27me3）——通常被上调，并已被认为与抑制参与免疫监视的基因有关（39, 40）。先前的报告表明，EZH2的抑制可以使癌细胞具有免疫原性，从而增强抗肿瘤免疫力（41, 42），但其在调节子宫内膜癌免疫监视中的作用尚未明确。为了评估抑制EZH2是否可以缓解可能限制HGEC PDOs中MHC表达的表观遗传阻塞，我们使用了FDA批准的EZH2抑制剂TAZ（43）。我们首先确认TAZ显著降低了HGEC PDOs中的H3K27me3水平，而不影响H3K27的乙酰化（补充图S4A–S4D）。与EZH2在沉默MHC途径中的作用一致，TAZ处理导致MHC-I和MHC-II的显著上调——特别是在ARID1A突变PDOs中（2例非洲人和1例欧洲人），而不影响PD-L1的表达（补充图S4E–S4H）。值得注意的是，TAZ预处理增强了我们自体共培养实验中的肿瘤–免疫细胞相互作用，表现为免疫细胞与PDOs的共定位增加以及肿瘤细胞凋亡增加（图3A–C；补充图S4I）。这些发现表明，通过EZH2抑制进行的表观遗传重编程可以恢复MHC表达并增强HGEC中的T细胞介导的细胞毒性。通过针对已经可以用FDA批准的抑制剂作用的表观遗传酶，这一策略为将EZH2阻断与免疫治疗方案结合以改善子宫内膜癌的结果提供了有希望的途径。图3。查看大图下载幻灯片。

EZH2抑制在HGEC类器官中增强MHC表达，从而增强了癌细胞与T细胞的相互作用。A，使用有无TAZ预处理的HGEC PDO以及自体PBMC、CD8和CD4 T细胞的共培养代表图像。刻度尺，70 μm。B，成像过程中PDOs与免疫细胞的共定位。共定位系数（R1）按照先前的方法计算（26）并归一化到初始时间点。曲线下面积用于统计显著性（普通t检验）。C，通过类器官与caspase-3信号之间的共定位系数测量共培养中PDOs的终点存活率。共定位系数按照先前的方法计算（26）并归一化到无免疫细胞对照（载体）。Cas3，caspase-3。使用普通单因素ANOVA（C）计算统计显著性（****，P < 0.0001）。图3。查看大图下载幻灯片。

我们建立了一个PDO–NK细胞共培养系统，以评估具有免疫调节潜力的小分子药物的治疗意义。

由于IFNγ处理恢复了HGEC PDOs中的MHC表达，这一恢复表明MHC抑制不仅仅是由于基因改变，还可能是由可逆的表观遗传机制驱动的。实际上，肿瘤抑制途径在各种癌症中经常通过组蛋白修饰而被沉默（38）。具体来说，组蛋白甲基转移酶EZH2——催化H3K27的三甲基化（H3K27me3）——通常被上调，并已被认为与抑制参与免疫监视的基因有关（39, 40）。先前的报告表明，EZH2的抑制可以使癌细胞具有免疫原性，从而增强抗肿瘤免疫力（41, 42），但其在调节子宫内膜癌免疫监视中的作用尚未明确。为了评估抑制EZH2是否可以缓解可能限制HGEC PDOs中MHC表达的表观遗传阻塞，我们使用了FDA批准的EZH2抑制剂TAZ（43）。我们首先确认TAZ显著降低了HGEC PDOs中的H3K27me3水平，而不影响H3K27的乙酰化（补充图S4A–S4D）。与EZH2在沉默MHC途径中的作用一致，TAZ处理导致MHC-I和MHC-II的显著上调——特别是在ARID1A突变PDOs中（2例非洲人和1例欧洲人），而不影响PD-L1的表达（补充图S4E–S4H）。值得注意的是，TAZ预处理增强了我们自体共培养实验中的肿瘤–免疫细胞相互作用，表现为免疫细胞与PDOs的共定位增加以及肿瘤细胞凋亡增加（图3A–C；补充图S4I）。这些发现表明，通过EZH2抑制进行的表观遗传重编程可以恢复MHC表达并增强HGEC中的T细胞介导的细胞毒性。通过针对已经可以用FDA批准的抑制剂作用的表观遗传酶，这一策略为将EZH2阻断与免疫治疗方案结合以改善子宫内膜癌的结果提供了有希望的途径。图3。查看大图下载幻灯片。

EZH2抑制在HGEC类器官中增强MHC表达，从而增强了癌细胞与T细胞的相互作用。A，使用有无TAZ预处理的HGEC PDO以及自体PBMC、CD8和CD4 T细胞的共培养代表图像。刻度尺，70 μm。B，成像过程中PDOs与免疫细胞的共定位。共定位系数（R1）按照先前的方法计算（26）并归一化到初始时间点。曲线下面积用于统计显著性（普通t检验）。C，通过类器官与caspase-3信号之间的共定位系数测量共培养中PDOs的终点存活率。共定位系数按照先前的方法计算（26）并归一化到无免疫细胞对照（载体）。Cas3，caspase-3。使用普通单因素ANOVA（C）计算统计显著性（****，P < 0.0001）。图3。查看大图下载幻灯片。

我们建立了一个PDO–NK细胞共培养系统，以评估具有免疫调节潜力的小分子药物的治疗意义。

NK细胞在免疫监视中起着重要作用，并且由于其对癌症的强大细胞毒性而成为有吸引力的治疗靶点（44, 45）。重要的是，通过下调MHC-I来逃避T细胞介导的免疫的肿瘤仍然可以通过“缺失自我”机制被NK细胞识别（46）。为了扩展我们的共培养平台的能力，我们建立了一个PDO–NK细胞共培养系统，并评估了NK细胞在HGEC中的细胞毒性（图4A）。共定位分析显示，在MHC-I表达较低的PDOs中NK细胞与癌细胞的相互作用强烈（图4B）和细胞毒性（图4C）。然而，用IFNγ预处理PDOs以提高MHC-I抗原呈递基因显著降低了NK细胞的共定位和细胞毒性。总体而言，这些发现强调了MHC-I调节与NK细胞对HGEC PDOs的细胞毒性之间的相互作用。此外，这一概念验证的PDO–NK细胞共培养系统为研究和优化未来基于NK细胞的免疫治疗策略提供了有价值的框架。图4。查看大图下载幻灯片。

类器官–NK细胞共培养和自体MMRp及MMRd类器官共培养验证了我们的平台。A. 使用HGEC PDO细胞系进行异种NK细胞共培养的代表性图像，其中包含或不包含IFNγ预刺激。红色和绿色荧光分别代表HGEC PDO细胞和相应的免疫细胞。蓝色荧光代表活跃的caspase 3信号。比例尺，70 μm。B. 在成像过程中PDO细胞和免疫细胞的共定位情况。曲线下面积用于统计显著性分析（普通t检验）。C. 通过类器官与caspase-3信号之间的共定位系数来测量共培养中PDO细胞的最终存活率。D. 使用MMRd和MMRp HGEC PDO细胞与自体PBMCs进行共培养的代表性图像。比例尺，70 μm。E. 通过流式细胞术测量MMRd和MMRp HGEC PDO细胞系的MHC-I、MHC-II和PD-L1蛋白表达水平。MFI表示平均荧光强度。F. 共培养14小时时PDO细胞和免疫细胞的共定位情况。G. 通过类器官与caspase-3信号之间的共定位系数来测量共培养12和20小时时MMRd PDO细胞的存活率。H. 通过类器官与caspase-3信号之间的共定位系数来测量共培养12和20小时时MMRp PDO细胞的存活率。Caspase-3。使用普通单因素ANOVA（C、G和H）和t检验（F）来计算统计显著性（*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001；****，P < 0.0001）。图4。查看大图/下载幻灯片。

类器官-NK细胞共培养以及自体MMRp和MMRd类器官共培养验证了我们的平台。A. 使用HGEC PDO细胞系进行异种NK细胞共培养的代表性图像，其中包含或不包含IFNγ预刺激。红色和绿色荧光分别代表HGEC PDO细胞和相应的免疫细胞。蓝色荧光代表活跃的caspase 3信号。比例尺，70 μm。B. 在成像过程中PDO细胞和免疫细胞的共定位情况。曲线下面积用于统计显著性分析（普通t检验）。C. 通过类器官与caspase-3信号之间的共定位系数来测量共培养中PDO细胞的最终存活率。D. 使用MMRd和MMRp HGEC PDO细胞与自体PBMCs进行共培养的代表性图像。比例尺，70 μm。E. 通过流式细胞术测量MMRd和MMRp HGEC PDO细胞系的MHC-I、MHC-II和PD-L1蛋白表达水平。MFI表示平均荧光强度。F. 共培养14小时时PDO细胞和免疫细胞的共定位情况。G. 通过类器官与caspase-3信号之间的共定位系数来测量共培养12和20小时时MMRd PDO细胞的存活率。H. 通过类器官与caspase-3信号之间的共定位系数来测量共培养12和20小时时MMRp PDO细胞的存活率。Caspase-3。使用普通单因素ANOVA（C、G和H）和t检验（F）来计算统计显著性（*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001；****，P < 0.0001）。关闭模式。

评估MMR状态对自体PDO细胞-免疫细胞相互作用的影响

DNA MMR基因（MSH2、MSH3、MSH6、MLH1、PMS1和PMS2）的突变会导致DNA突变的积累，这可能增加新抗原的产生。因此，MMRd肿瘤通常表现出更高水平的肿瘤浸润淋巴细胞，并且与MMRp肿瘤相比，对anti-PD-1治疗的反应通常更积极（47）。为了研究MMR状态对我们自体系统中癌症-免疫细胞相互作用的影响，我们使用了来自生物库的MMRp和MMRd HGEC PDO细胞及其相应的PBMCs（图4D）。这些PDO细胞具有相似的MHC-I、MHC-II和PD-L1表达水平（图4E）。与先前的报告一致，这些报告表明MMRd肿瘤与子宫内膜癌中的增强免疫浸润相关（48, 49），MMRd PDO细胞在共培养过程中表现出更强的免疫细胞相互作用（图4F）和更早的肿瘤细胞凋亡（图4G和H），相比MMRp PDO细胞。这些发现表明，我们的自体系统能够真实地捕捉到MMRd子宫内膜癌中观察到的增强免疫原性，这通常是它们对检查点阻断免疫治疗反应改善的基础。通过再现肿瘤-免疫动态中的MMR依赖性变化，我们的平台为阐明免疫逃逸机制和评估针对HGEC MMR状态定制的新免疫治疗策略提供了宝贵的资源。

评估下一代双特异性T细胞结合剂的治疗效果

双特异性T细胞结合剂（TCE）作为一种有前景的免疫治疗类别，特别是在血液系统恶性肿瘤中，通过同时结合肿瘤抗原和T细胞上的CD3复合物来诱导靶向细胞毒性。然而，由于真正肿瘤特异性抗原的有限可用性和潜在的靶内/靶外毒性，它们在实体瘤中的应用仍然具有挑战性（50）。为了测试我们的自体PDO细胞-免疫细胞共培养平台是否可以用于评估新型TCE模式在HGEC中的治疗效果，我们使用了两种成分引导的抗体肿瘤结合剂（TwoGATE）。TwoGATE是一种基于半衰期延长的VH和VL稳定分裂表位设计的条件性TCE系统，带有可被蛋白酶切割的多肽连接子（补充图S5）。该设计旨在将T细胞激活限制在肿瘤微环境（TME）中，从而减轻全身毒性。我们设计了针对HGEC PDO细胞上的EpCAM和T细胞上的CD3的构建体，连接子可以通过matriptase、uPA或CTSB选择性地切割。已知这些蛋白酶在TME中显著富集（51）。使用具有不同Epcam水平的MMRd和MMRp HGEC PDO细胞系（图5A），我们将每种细胞系与自体PBMCs共培养，以评估免疫介导的肿瘤细胞杀伤（图5B和C）。图5。查看大图/下载幻灯片。

双特异性TCE构建体促进了癌症-免疫细胞的相互作用。A. 通过流式细胞术测量MMRd和MMRp PDO细胞系的EpCAM蛋白表达水平。MFI表示平均荧光强度。B. 使用MMRd HGEC PDO细胞进行自体共培养的代表性图像。红色和绿色荧光分别代表类器官和相应的免疫细胞。蓝色荧光代表活跃的caspase 3信号。比例尺，70 μm。C. 使用MMRp HGEC PDO细胞进行自体癌症-免疫细胞共培养的代表性图像。比例尺，70 μm。D. 共培养7小时时MMRd HGEC PDO细胞和免疫细胞的共定位情况。E. 通过共培养12小时时类器官与caspase-3信号之间的共定位系数来测量MMRd PDO细胞的存活率。F. 共培养42小时时MMRp HGEC PDO细胞和免疫细胞的共定位情况。G. 共培养46小时时类器官与caspase-3信号之间的共定位系数来测量MMRd类器官的存活率。Caspase-3。使用t检验（A）和普通单因素ANOVA（D–G）来计算统计显著性（*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001；****，P < 0.0001）。图5。查看大图/下载幻灯片。

所有三种可被蛋白酶切割的TwoGATE构建体在MMRd（图5D）和MMRp（图5F）HGEC PDO细胞中显著增加了自体肿瘤-免疫细胞的共定位。这种增强的相互作用伴随着强烈的细胞毒性，表现为PDO细胞中caspase-3/7活性的升高（与未经处理的对照组相比，图5E和G）。相比之下，不可切割的TwoGATE构建体没有引起共定位或凋亡的变化，这强调了在TME中依赖蛋白酶激活TwoGATE的必要性。值得注意的是，尽管MMRp PDO细胞的Epcam表达更高，但其凋亡开始时间（12小时）比MMRd PDO细胞（46小时）更早。总的来说，这些发现证明了我们的自体PDO细胞-免疫细胞共培养系统能够评估下一代TCE在HGEC中的特异性和有效性，从而为优化免疫治疗策略提供了宝贵的临床前平台。

评估CAR-T细胞在HGEC PDO细胞中的特异性和有效性

CAR-T细胞已被批准用于治疗某些类型的血液系统恶性肿瘤，并且目前正在实体瘤中进行积极研究。表皮生长因子（EGFR）的过表达与子宫内膜癌的不良预后相关（52, 53）。此外，EGFR酪氨酸激酶抑制剂厄洛替尼在体外和体内的高EGFR表达HGEC模型中显示出治疗效果（54）。因此，为了利用我们的PDO细胞-免疫细胞共培养平台作为评估CAR-T细胞疗法效果的临床前测试工具，我们选择了EGFR作为目标。我们首先使用qPCR和流式细胞术筛选了生物库中的24个子宫内膜癌PDO细胞系（11个AFR、8个EUR、4个SAS和1个混合型）的EGFR表达情况。我们发现不同PDO细胞系之间的EGFR表达水平存在差异（补充图S6A和S6B），总体上HGEC PDO细胞的EGFR表达水平高于LGEC和正常PDO细胞（补充图S6C和S6D）。为了进行概念验证实验，我们选择了一个高EGFR表达的HGEC PDO细胞系（AFR）、一个低EGFR表达的HGEC PDO细胞系（混合型）和一个低EGFR表达的正常子宫内膜PDO细胞系（SAS；补充图S6E和S6F）。使用这些模型，我们在共培养系统中评估了EGFR靶向CAR-T细胞的安全性和有效性（55）。我们的结果表明，EGFR CAR-T细胞的细胞毒性效果与靶细胞中的EGFR表达水平密切相关（图6A）。具体来说，高EGFR水平的HGEC PDO细胞表现出增强的T细胞共定位（图6B）和强烈的CAR-T细胞介导的肿瘤细胞凋亡（图6C），而低EGFR表达的HGEC PDO细胞则表现出显著减弱的反应。重要的是，与EGFR CAR-T细胞共培养的正常子宫内膜PDO细胞没有显示出显著的细胞毒性，证实了该方法的特异性和安全性。这些发现突显了我们自体PDO细胞-免疫细胞共培养平台的敏感性和稳健性，该平台能够根据靶抗原表达有效区分治疗反应。因此，我们的系统为优化晚期或复发性子宫内膜癌的个性化CAR-T细胞疗法提供了强大的临床前工具，这些癌症迫切需要有效的靶向免疫治疗。图6。查看大图/下载幻灯片。

CAR-T细胞在子宫内膜类器官中表现出靶标依赖性活性。A. 使用正常和两个EGFR水平不同的HGEC PDO细胞（低和高EGFR）进行共培养的代表性图像，其中不包含免疫细胞，或者使用未转导的CD8 T细胞（模拟）或EGFR-CAR-T细胞（55）。红色和绿色荧光分别代表子宫内膜类器官和相应的免疫细胞。蓝色荧光代表活跃的caspase 3信号。比例尺，70 μm。B. 在成像过程中PDO细胞和相应免疫细胞的共定位情况。共定位系数（R1）按照之前的方法计算（26）并归一化到初始时间点。曲线下面积用于统计显著性分析（普通t检验）。C. 通过PDO细胞和caspase-3信号之间的共定位系数来测量共培养中PDO细胞的最终存活率。共定位系数按照之前的方法计算（26）并归一化到无免疫细胞对照组（载体）。Caspase-3。D. 描述了自体PDO细胞-免疫细胞共培养系统使用的示意图。MSI-H表示微卫星不稳定；MSS表示微卫星稳定。使用普通单因素ANOVA（C）来计算统计显著性（*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001）。图6。查看大图/下载幻灯片。

CAR-T细胞在子宫内膜类器官中表现出靶标依赖性活性。A. 使用正常和两个EGFR水平不同的HGEC PDO细胞（低和高EGFR）进行共培养的代表性图像，其中不包含免疫细胞，或者使用未转导的CD8 T细胞（模拟）或EGFR-CAR-T细胞（55）。红色和绿色荧光分别代表子宫内膜类器官和相应的免疫细胞。蓝色荧光代表活跃的caspase 3信号。比例尺，70 μm。B. 在成像过程中PDO细胞和相应免疫细胞的共定位情况。共定位系数（R1）按照之前的方法计算（26）并归一化到初始时间点。曲线下面积用于统计显著性分析（普通t检验）。C. 通过PDO细胞和caspase-3信号之间的共定位系数来测量共培养中PDO细胞的最终存活率。Cas3，caspase-3。D. 描述了自体PDO细胞-免疫细胞共培养系统的示意图。MSI-H表示微卫星不稳定；MSS表示微卫星稳定。使用普通单因素ANOVA（C）来计算统计显著性（*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001）。图6。查看大图/下载幻灯片。B. 在成像过程中，PDOs与相应免疫细胞的共定位情况。共定位系数（R1）按照先前的方法（26）计算，并归一化到初始时间点。曲线下面积用于统计显著性分析（普通t检验）。C. 通过PDOs与caspase-3信号之间的共定位系数来测量共培养中PDO的终点存活率。共定位系数的计算方法同前（26），并归一化到无免疫细胞对照组（空白对照）。Caspase-3是凋亡相关蛋白。D. 示意图展示了自体PDO-免疫共培养系统的应用。MSI-H表示微卫星高度不稳定；MSS表示微卫星稳定。使用普通单因素方差分析（ANOVA）来计算统计显著性（*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001）。

讨论

自体PDO-免疫共培养系统在个性化肿瘤学领域代表了重大进展，尤其是在治疗选择有限且患者预后较差的HGEC（高级子宫内膜癌）中（56）。在子宫内膜癌的研究中，大多数先前的PDO研究集中在LGEC（低级别子宫内膜癌）的PDOs上（10, 11）。少数研究建立了HGEC的PDOs并描述了它们的分子特征，为药物开发提供了有用信息（10, 12）。然而，这些PDOs主要来自欧洲血统的患者，因此对非欧洲人群的代表性不足（11, 12）。此外，由于使用了可能引发异体免疫反应的非自体免疫细胞，癌症-免疫细胞相互作用的表征也受到限制（57, 58）。我们的平台使用了来自种族多样性患者群体的HGEC PDOs，其中包括大量非洲血统的患者，这一群体在现有模型和数据集中严重代表性不足，但却是这种侵袭性疾病的重点影响对象（60, 61）。通过将自体免疫细胞整合到培养系统中，我们能够捕捉到患者特异性的肿瘤-免疫相互作用，并克服了由HLA不匹配引起的异体系统的固有局限性。我们认为，我们的自体PDO-免疫细胞共培养平台为HGEC的研究提供了临床相关、可扩展且可持续的模型，用于研究癌症-免疫相互作用并评估免疫治疗干预的有效性。首先，来自不同血统的子宫内膜癌PDOs可以更好地反映免疫标志物的稳态表达水平，这有助于预测对免疫治疗的反应性。尽管我们的队列包括了多种血统的患者，但目前的研究尚不足以进行基于血统的分层功能比较。因此，我们将血统信息作为队列特征进行描述，并专注于提供HGEC及其匹配的肿瘤-正常组织的分子/功能分析的概念验证示例。我们发现HGEC PDOs的抗原呈递和加工能力降低，尤其是MHC-II的表达减少，这可能导致免疫逃逸和对免疫检查点抑制剂的反应不佳。接下来，我们发现通过刺激IFNγ信号通路或抑制EZH2可以恢复MHC-I和MHC-II的表达，从而促进自体免疫细胞对癌细胞的杀伤作用。这些结果表明，增强MHC表达的药物可能提高HGEC中的免疫反应，并表明我们的系统可用于筛选在传统体外实验中无法发现的新型免疫治疗剂。需要进一步的研究来阐明调控HGEC中MHC表达沉默和恢复的因果表观遗传机制。癌细胞内在的MHC-II在调节抗肿瘤免疫中起着双重作用：一方面，正如我们和其他研究者最近所展示的，癌细胞中的高MHC-II水平有助于有效向CD4+ T细胞呈递抗原，从而促进抗肿瘤免疫监视（32, 62–64）；另一方面，我们在乳腺癌淋巴结转移的研究中发现，在缺乏足够共刺激信号的情况下，升高的MHC-II表达会驱动调节性T细胞反应并抑制抗肿瘤免疫（35）。我们使用自体HGEC PDO-免疫共培养系统的数据表明，提高MHC-II表达可以增强CD4+ T细胞对癌细胞的杀伤作用。具体来说，当初始MHC-II水平较低的HGEC PDOs经过IFNγ处理以恢复MHC表达时，我们观察到CD4+ T细胞的参与显著增加，随后肿瘤细胞发生凋亡。这些发现表明，在HGEC中，提高MHC-II表达可能更倾向于促进免疫监视而非免疫逃逸。需要进一步研究来探讨提高HGEC中MHC-II表达是否通过刺激强烈的CD4+ T细胞反应来增强抗肿瘤免疫。我们的平台有效地揭示了肿瘤抗原性对抗肿瘤免疫的影响，并有助于评估多种免疫治疗方式在HGEC中的有效性。与临床对免疫治疗的反应性一致，MMRd（微卫星不稳定）的HGEC PDOs表现出更早且更明显的免疫细胞介导的凋亡，而MMRp（微卫星稳定）的PDOs则不然。我们还使用多种免疫治疗方式（包括NK细胞转移、双特异性T细胞和EGFR靶向CAR-T细胞）验证了我们的系统，证明了治疗效果与关键肿瘤特征（如目标抗原表达水平）的相关性。这些全面的验证突显了我们自体共培养平台的稳健性和敏感性，使其成为优化HGEC免疫治疗方式的强大临床前工具。此外，我们的系统还可以从共培养中生成肿瘤特异性的自体T细胞，这些T细胞可用于识别HGEC的共有新抗原。虽然我们的平台为研究子宫内膜癌中的癌症-免疫相互作用提供了强大的工具，但它并未完全涵盖TME（肿瘤微环境）的其他关键组成部分，如基质细胞（65）和其他抗肿瘤免疫调节因子（如微生物组（66, 67）。将我们的体外共培养系统扩展到缺乏MHC-I和MHC-II的免疫缺陷小鼠体内模型（68）中，可以更全面地反映HGEC复杂的TME。这种体内自体PDO-免疫细胞重建模型可用于评估免疫治疗方式对HGEC的安全性和有效性。为了公平转化基于PDO的精准医疗方法，需要更多社区的参与和沟通。我们建议定期监测不同社区的招募情况，并纳入社区顾问，以确保这些新资源能够帮助填补癌症研究和护理中的现有空白。总之，我们的发现强调了自体PDO-免疫细胞共培养系统（图6D）在推进我们对肿瘤-免疫动态的理解以及指导新型免疫治疗策略开发方面的潜力。通过纳入多样化的患者样本并关注关键的免疫调节通路，我们的工作为优化利用免疫系统对抗这种侵袭性恶性肿瘤的疗法奠定了坚实的基础，同时也解决了当前临床前模型中的关键问题。

数据可用性

批量RNA-seq数据可通过Gene Expression Omnibus访问，访问号为GSE307568。本研究生成的所有其他数据可向相应作者索取。

作者披露

M. Frimer在研究期间接受了AbbVie、Merck、AstraZeneca和GSK的个人费用。S. Beyaz在研究期间还接受了Revitope Oncology和Caper Labs的资助。W. Meier、K. Simon和M. Viola在研究期间是Revitope Oncology的员工。其他作者没有披露任何利益关系。

作者贡献

C. Chung：概念设计、数据整理、正式分析、研究方法、初稿撰写、审稿和编辑。B. Yueh：数据整理、方法学研究。S. Subhash：正式分析、数据可视化。O. Eskiocak：数据整理、研究。A. Nizam：数据整理、研究方法、审稿和编辑。M. Viola：资源支持。P. Belleau：正式分析。A. Kredentser：数据整理、研究。A. Kapedani：资源支持。A. Krasnitz：正式分析。K. Simon：资源支持。W. Meier：资源支持、审稿和编辑。M. Frimer：资源支持、审稿和编辑。G.L. Goldberg：资源支持、审稿和编辑。S. Beyaz：概念设计、资源协调、资金获取、研究、审稿和编辑。

致谢

我们感谢Beyaz实验室的成员们进行的宝贵讨论。感谢Northwell Health Biospecimen Repository和妇科肿瘤学团队在招募具有不同人口统计学特征的患者以及获取研究样本方面提供的帮助。感谢Harvard Medical School的Marcela Maus博士提供的EGFR-CAR T细胞。感谢Cold Spring Harbor Laboratory癌症中心的共享资源（流式细胞术、显微镜技术、测序、类器官和组织学设施），这些资源部分得到了美国国家癌症研究所癌症中心支持基金（5P30CA045508）的资助。特别感谢CSHL显微镜部门的Erika Wee在共培养平台共聚焦成像优化过程中提供的帮助。本研究的资金支持来自美国国家癌症研究所（R37CA292807）、Oliver S.和Jennie R. Donaldson慈善信托基金、Mark癌症研究基金会（20-028-EDV）、Cold Spring Harbor Laboratory以及Northwell Health Affiliation的New York Genome Center Polyethnic-1000计划。本文的补充数据可在Cancer Research Communications Online（https://aacrjournals.org/cancerrescommun/）获取。