分析物与内标之间的碰撞能量一致性：通过LC-MS/MS准确定量类固醇激素的关键因素

《Talanta》：Collision Energy Consistency Between Analyte and Internal Standard: A Critical Factor for Accurate Quantification of Steroid Hormones by LC-MS/MS

液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）多激素同步定量分析中，碰撞能量（CE）不一致导致的高浓度激素（如皮质醇）显著偏差（15-92%）是关键问题。采用双CE采集方法，发现同步CE设置（LCE-LCE）或优化同位素离子transitions可将偏差降至15%以下。仪器性能下降会放大CE不一致的影响，提示临床应用需严格验证CE一致性，并定期维护仪器。

　　

马晓莉|罗伟|蔡益轩|李明|程倩|于松林|邱玲

北京协和医学院医院临床实验室，北京协和医学院与中国医学科学院，北京100730，中国

摘要

使用LC-MS/MS同时定量生理浓度差异极大的类固醇激素时，通常需要调整碰撞能量（CE）设置，这可能会引入不准确性。本研究探讨了分析物与其稳定同位素标记内标（SIL-IS）之间的CE一致性对定量准确性的关键影响，采用的是三重四极杆LC-MS/MS系统。我们使用一种新的双CE采集方法分析了61份血浆样本中的六种激素，在低CE和最佳CE下监测SIL-IS的响应。在更换碰撞池后，该方法再次应用于70份患者样本以评估仪器依赖性。当分析物与SIL-IS之间的CE设置不匹配（LCE-HCE）时，高浓度分析物出现了显著的仪器特异性偏差（15-92%）。在仪器性能下降的情况下，这些偏差更为明显。同步CE设置（LCE-LCE）或使用始终优化的同位素跃迁可以恢复准确性，优化后的平均偏差降至15%以下。处于最佳状态的仪器显示出最小的CE依赖性偏差。在多分析物类固醇检测中，不一致的CE应用是定量不准确性的隐藏来源，而仪器条件的不佳会加剧这一问题。尽管这些发现提供了重要的方法学见解，但还需要在不同LC-MS/MS平台上进行进一步研究以确定其普遍性。我们强烈建议在方法验证和仪器故障排除过程中验证CE的一致性。

引言

液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）已成为临床类固醇激素分析的金标准，因为它具有出色的特异性和多重检测能力，这对于诊断和监测复杂的内分泌疾病（如先天性肾上腺增生症（CAH）¹、库欣综合征²和多囊卵巢综合征（PCOS）³等）至关重要。然而，同时分析多种类固醇的一个根本挑战是不同分析物之间的生理浓度范围差异巨大，从高丰度的皮质醇到痕量水平的醛固酮^{4, 5, 6}。为了避免检测器饱和，实验室通常会降低这些化合物的碰撞能量（CE），同时保持相应的稳定同位素标记内标（SIL-IS）在更高的、优化灵敏度的能量水平。这种常规的CE不匹配做法虽然在实际操作中解决了线性限制问题，但依赖于一个关键且未经验证的假设：即分析物及其SIL-IS对仪器漂移和性能变化具有恒定的响应。最重要的是，这种广泛采用的方法是否会导致显著的定量偏差仍不清楚，这代表了临床类固醇分析中一个被忽视的潜在不准确性来源。

在质谱学中，CE在对映体测量中的关键作用已有充分记录⁷。CE直接决定了前体离子的裂解效率，从而影响灵敏度、信噪比以及最终的对映体区分能力。对于类固醇激素而言，由于其常常经历复杂的、结构依赖性的裂解途径，即使与优化CE条件略有偏差也会导致产物离子产量的显著变化。这种内在的CE敏感性在多分析物检测中造成了方法学上的冲突：为高浓度分析物保证线性而妥协的CE设置可能会同时引入无法量化的不准确性。尽管以往的方法强调在单分析物情况下最大化灵敏度，但在多重临床检测中系统地研究分析物与其SIL-IS之间的同步CE设置仍然是文献中的一个明显且重要的空白。

我们实验室参与的外部质量评估（EQA）方案直接揭示了这一方法学空白。值得注意的是，六种类固醇化合物显示出显著的测量偏差，其中孕酮的偏差最为明显，超过了90%。尽管采用了完全验证的LC-MS/MS方法和遵循了既定的内部质量控制协议⁸，这些系统性不准确性仍然存在。这种未被传统验证方法发现的显著偏差表明了当前多分析物类固醇分析方法框架的根本局限性。我们假设分析物与其对应的SIL-IS之间不一致的CE应用是这些差异的重要原因，而这一问题似乎会因仪器性能下降（如碰撞池老化或电压漂移）而加剧。

为了实验验证碰撞能量设置对定量结果的影响，我们设计了一项全面的研究，比较了仪器维护前后不同的CE配置。采用了一种新的双CE采集协议，能够在低能量（与分析物同步）和最佳能量（常规）设置下同时监测内标的响应。这种方法允许在不同CE条件下通过内标校正后的定量结果进行直接比较。该分析策略在更换碰撞池前后均系统地应用于患者样本，从而创建了一个用于研究仪器依赖性效应的受控框架。为了建立正交的验证基准，我们进一步采用了在始终优化的CE条件下分析的替代同位素跃迁。这种多方面的方法提供了三个不同的定量视角：常规不匹配（LCE-HCE）、同步能量（LCE-LCE）和基于同位素跃迁的定量，从而能够有效区分CE引起的偏差与其他分析变化。

通过这种综合实验设计，我们证明了分析物与其对应的内部标准之间的同步CE设置对于减少仪器特异性偏差至关重要，为临床LC-MS/MS实践中实现可靠的类固醇激素定量提供了重要的方法学考虑。

化学品和试剂

孕酮（P）、雄烯二酮（A4）、睾酮（T）、皮质醇和可的松的标准品购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）；11-脱氧皮质酮（DOC）购自TRC（加拿大多伦多）。内部标准品包括P-d₉、皮质醇-d₄、可的松-d₈和DOC-d₇（TRC，加拿大多伦多）；A4-¹³C₃（IsoScience，美国宾夕法尼亚州安布勒）；以及T-¹³C₃（Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）。无激素血浆（SeraCon? II CD Hormone Depleted Double-Stripped Negative Diluent，目录编号）

结果

如图1和2所示，在不同能量依赖的内标离子对校正下，六种激素（A4、皮质醇、可的松、DOC、P和T）的检测结果显示出强烈的线性相关性，相关系数（r）均大于0.9844，显著性水平P<0.0001，95%置信区间较窄——表明在仪器检修前后一致性很高。线性方程的结果和平均偏差显示在表2中。

讨论

本研究首次报告了使用三重四极杆LC-MS/MS系统时碰撞能量设置对多类固醇激素检测的影响，为优化定量分析中的离子对能量参数提供了关键见解。我们的发现表明，分析物与其同位素标记内标（SIL-IS）之间的CE差异可能会导致显著偏差，这些偏差会因仪器性能漂移而放大。鉴于实验条件...

结论

本实验表明，在同时检测多种激素时，分析物与其SIL-IS的CE设置一致性在确保结果准确性和方法稳健性方面起着重要作用。特别是在仪器性能不佳的情况下，观察到的偏差会被显著放大，而这种情况可能不易通过常规的性能监测发现。这项研究为临床质谱学提供了关键的实验证据。

CRediT作者贡献声明

于松林：撰写 – 审稿与编辑、监督、方法学设计、资金获取、概念构思。邱玲：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源管理、项目协调。李明：方法学设计、数据管理。程倩：监督、资源协调。罗伟：撰写 – 初稿撰写、验证、数据管理。蔡益轩：撰写 – 初稿撰写、数据管理。马晓莉：撰写 – 初稿撰写、验证、软件应用、实验设计、数据分析

伦理声明

该研究获得了北京协和医学院中国医学科学院伦理委员会的批准（批准编号I-25PJ0528）。由于本研究使用了剩余的临床样本，因此未给患者带来额外风险。

资助

本研究由非传染性疾病-国家科学技术重大项目（2024ZD0533200、2024ZD0533206）和北京市自然科学基金（L254031）资助。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。