《Veterinary Microbiology》：IL-17 Signaling Pathway in Monocytes Drives the persistent inflammatory cytokine storm caused by
Glaesserella parasuis infection in pigs
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猪lets感染Glaesserella parasuis引发持续性炎症反应，血清蛋白质组学（24/48/72小时4D-DIA）揭示IL-17信号通路为核心驱动因素，其受体IL-17RA与TRAF6复合物激活NF-κB和MAPK通路，导致促炎细胞因子风暴及多器官炎症损伤。
王佩毅|吴爱华|牛建宁|刘伟|傅树林|张彦彦|宗冰冰|邱银生
中国湖北省动物营养与饲料科学重点实验室，武汉理工大学，武汉430023
摘要
Glaesserella parasuis是导致格拉瑟病（Gl?sser’s disease）的病原体，是一种重要的猪病原体，其特征为纤维性多浆膜炎、脑膜炎和关节炎，对全球养猪业造成了重大经济损失。在本研究中，G. parasuis感染猪仔后引发了持续的全身炎症反应，表现为血液中促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α）和急性期蛋白（SAA、HP）的mRNA表达水平持续升高。这种反应伴随着肺部、心脏、脾脏和心包中的严重炎症细胞浸润，从而导致高死亡率。这些发现表明G. parasuis在猪体内引发了持续的炎症细胞因子风暴，但其背后的分子机制尚未阐明。通过对感染后24小时、48小时和72小时的猪仔血清进行蛋白质组学分析（使用4D数据独立采集技术4D-DIA），发现IL-17信号通路是主要致病因素。这一发现得到了感染期间IL-17A受体（IL-17RA）血清浓度逐渐增加的支持。此外，后续的体外实验表明，在G. parasuis感染的单核细胞中，IL-17A、IL-17RA、TRAF6、磷酸化p65、JNK和ERK的表达显著上调。综上所述，本研究表明G. parasuis感染的单核细胞通过IL-17RA/TRAF6复合体激活NF-κB和MAPK信号通路，并提示IL-17信号通路在G. parasuis感染期间持续炎症风暴中起关键作用。
引言
Glaesserella parasuis是一种常见的猪呼吸道病原体，也是格拉瑟病的致病因子。该病在临床上表现为纤维性多浆膜炎、脑膜炎和关节炎，给全球养猪业带来了巨大的经济损失（Aragon等人，2010年；Smart等人，1989年）。其致病机制涉及多种毒力因子，包括脂多糖（LPS），LPS可促进该菌附着于猪脑微血管内皮细胞（PBMECs）并触发促炎细胞因子（IL-6、IL-8）的释放（Bouchet等人，2008年）。细胞致死膨胀毒素（CDT）可导致猪肾（PK-15）和肺泡巨噬细胞（PAM）细胞周期停滞和p53依赖性凋亡（Li等人，2017a年）。关键的毒力基因包括vacJ，它对生物膜形成、血清抵抗性和PK-15细胞黏附/侵袭至关重要（Zhao等人，2017年）；而SC096菌株中的rfaE缺失会削弱血清抵抗性和内皮/上皮细胞间的相互作用（Zhang等人，2014年）。尽管对这些因子进行了广泛研究，但驱动感染猪持续炎症反应的分子机制仍不完全清楚。
炎症是一种保护性免疫机制，可在病原体或组织损伤时协调免疫系统与血管系统的相互作用（Fioranelli等人，2021年）。G. parasuis感染会导致强烈的持续炎症反应，从而造成严重的组织和器官损伤。关键研究表明，感染猪的淋巴结、大脑、脾脏和肺部中的促炎细胞因子（IL-1α、TNF-α、IFN-γ）水平升高（de la Fuente等人，2009年）。体外实验表明G. parasuis通过激活TLR/NF-κB、NLRP3/caspase-1、PKC-MAPK等信号通路诱导猪血管内皮细胞的炎症反应和凋亡（Fu等人，2018年；Fu等人，2019年）。G. parasuis还激活单核细胞和内皮细胞中的TLR/NF-κB、NOD/RIP2和NLRP3/caspase-1通路，从而产生炎症介质（Ye等人，2019年；Luo等人，2021年；Yang等人，2022年）。虽然这些发现证实了多种信号通路参与细胞因子的产生，但它们未能完全解释感染动物中观察到的持续且常常失调的炎症风暴（Fu等人，2018年；Fu等人，2019年；Ye等人，2019年；Luo等人，2021年；Yang等人，2022年）。G. parasuis在猪体内引发的持续炎症反应仍知之甚少，关于参与该过程的免疫细胞动态、信号通路和细胞因子网络的报道也非常有限。
蛋白质组学是一种系统研究蛋白质表达模式及其调控机制的方法（Li等人，2017b年），为疾病发病机制的研究提供了有力的框架。它能够分析蛋白质差异和相互作用，从而揭示疾病机制的新见解、诊断生物标志物、治疗效果和靶点识别（Tian等人，2022年）。血清蛋白质组学凭借其系统性、动态性和高灵敏度特点，是研究G. parasuis诱导的炎症反应时间变化的理想工具。在本研究中，我们采用了4D数据独立采集（4D-DIA）血清蛋白质组学技术来分析不同感染时间点猪仔血清中的蛋白质表达情况，并通过实验鉴定了与持续炎症反应相关的差异蛋白质及其相关信号通路。
部分内容摘要
2.1 伦理声明
所有涉及猪的实验程序均遵循中国湖北武汉理工大学动物护理和使用委员会的指导方针并获得其批准（WPU20230717）。
细菌菌株及培养条件
本研究使用了高毒力的Glaesserella parasuis 5型菌株SH0165。该菌株最初是从一只出现关节炎、纤维性多浆膜炎、出血性肺炎和脑膜炎临床症状的商业猪的肺部分离得到的。
G. parasuis感染在猪仔体内引发持续的全身炎症反应和病理损伤
为了研究宿主对G. parasuis感染的炎症反应，我们量化了关键免疫介质的表达并评估了实验感染猪仔的组织病理变化。通过qRT-PCR分析全血发现，与基线相比（0小时），感染后24小时的促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α以及抗炎细胞因子IL-10的mRNA水平显著升高。
讨论
先前的研究已经证实G. parasuis通过引发猪的持续炎症反应导致血管损伤（Fu等人，2018年；Ye等人，2019年；Luo等人，2021年；Yang等人，2022年）。然而，G. parasuis感染如何刺激大量炎症因子的释放并导致持续炎症状态的精确机制在猪仔体内仍不清楚。为了阐明这些致病机制，建立可靠的动物模型至关重要。
CRediT作者贡献声明
吴爱华：数据验证、方法学研究、数据整理。王佩毅：初稿撰写、数据可视化、方法学研究、数据分析、数据整理。刘伟：数据验证、方法学研究。牛建宁：数据验证。张彦彦：初稿撰写与编辑、研究指导、方法学研究、概念构思。傅树林：方法学研究、研究实施、概念构思。邱银生：研究指导、方法学研究、资金申请。宗冰冰：初稿撰写与编辑。致谢
本研究得到了中国湖北省重点研发计划（2023BBB069）的支持。
