在大肠杆菌中表达的奥密克戎RBD蛋白，在小鼠体内产生高效中和SARS-CoV-2抗体的能力方面，优于在哺乳动物细胞中表达的S1刺突蛋白

《Virology》：Omicron RBD expressed in E. coli outperforms mammalian-expressed S1 spike protein in generating highly neutralizing anti-SARS-CoV-2 antibodies in mice

SARS-CoV-2亚单位疫苗研发中，大肠杆菌表达的奥密克戎BA.5刺突蛋白受体结合域（RBD）在5μg×2剂无佐剂方案下即可引发强效体液和细胞免疫应答，其效果优于哺乳动物表达的S1蛋白。RBD的高纯度（RP-HPLC纯化）、完整二硫键（含4个天然二硫键）及ACE2结合区域富集，可能是其免疫原性优于完整S蛋白的关键因素。研究证实RBD在佐剂依赖性、成本效益和可扩展性方面具有显著优势，为开发下一代经济高效的亚单位疫苗提供了新思路，同时可作为血清学检测工具。

　　

王泽林|Wongnak Rawiwan|Oba Mami|Mizutani Tetsuya|Islam Monirul|M. Kuroda Yutaka

东京农工大学工程学院生物技术与生命科学系，日本东京小金井中町2-24-16，邮编184-8588

摘要：

SARS-CoV-2变种具有高传染性、频繁突变以及逃避免疫反应的能力，这凸显了开发经济实惠且易于扩展的疫苗平台的迫切需求。我们之前报道过，由大肠杆菌表达的Omicron BA.5和武汉变种的受体结合域（RBD），在每只小鼠注射30微克、共4次后，能够诱导强烈的体液和细胞免疫反应。在此研究中，以Omicron BA.5为模型，我们证明了仅使用5微克、注射2次的由大肠杆菌表达的RBD，即使不添加佐剂，也能引发强烈的抗SARS-CoV-2免疫反应。相比之下，哺乳动物表达的S1刺突蛋白（S1）在相同条件下未能达到这种效果。添加TiterMax Gold佐剂后，RBD和S1都能诱导T细胞记忆反应并平衡免疫应答；然而，RBD始终表现出更强的免疫效果。此外，抗RBD血清在伪病毒中和实验中也能中和SARS-CoV-2。RBD的优异免疫原性可能归因于其高纯度（通过RP-HPLC纯化）、接近天然构象（包含所有四个天然二硫键），以及通过聚焦ACE2受体结合区域富集了关键中和表位。总体而言，这些结果表明由大肠杆菌表达的RBD是一种有前景、安全且成本效益高的下一代亚单位疫苗候选抗原，同时也可能成为血清学检测的宝贵工具。

引言

尽管由SARS-CoV-2引起的COVID-19大流行已经正式结束，但它对公共卫生系统的影响仍然显著（Pollard等人，2020年）。病毒迅速进化，出现了Omicron及其亚谱系等变种，这要求不断更新疫苗策略（Khandia等人，2022年；Zhang等人，2022年）。尽管疫苗以前所未有的速度研发并在全球范围内推广，但每天仍有多达数万例新感染病例报告（WHO COVID-19数据 dashboard，2025年）。老年人和患有高血压、糖尿病或心血管疾病等基础疾病的人群仍然特别容易受到SARS-CoV-2引起的中长期并发症的影响（Maru?i?等人，2024年）。因此，尽管大流行的急性阶段已经过去，但仍迫切需要更有效且易于获取的疫苗平台来应对当前和新兴的变种（Krammer，2020年）。

除了灭活疫苗和减毒活疫苗（其使用受到限制，Khoshnood等人，2022年）之外，还开发了多种针对COVID-19的疫苗平台，包括mRNA疫苗和蛋白质亚单位疫苗；某些国家还使用了腺病毒载体疫苗（Wang等人，2022年）。虽然mRNA疫苗应用最广泛，但亚单位疫苗被认为可以减少不良反应，这可能是因为它们的成分较少且结构明确（Mirtaleb等人，2023年）。亚单位COVID-19疫苗的研究通常集中在全长蛋白质上，特别是三聚体刺突（S）蛋白，这种蛋白在哺乳动物细胞中表达以确保正确的折叠和必要的翻译后修饰（如糖基化），这些修饰通常被认为对于引发适当的免疫反应至关重要。

然而，与细菌生产相比，哺乳动物表达系统存在一些缺点，包括成本高昂、基础设施要求复杂、生产周期较长、可扩展性有限，以及存在动物病毒污染的风险（“杆状病毒与哺乳动物表达”，无日期）。这些限制重新引起了人们对细菌表达系统的兴趣，因为它提供了实际优势，并可能仍然能够引发适合疫苗开发的免疫反应（Terpe，2006年）。

细菌表达系统，特别是大肠杆菌，通常被用作生产小型到中型重组蛋白的简单、可扩展、快速且成本效益高的方法，并广泛应用于各种医疗和制药产品的生产（Rosano和Ceccarelli，2014年）。然而，细菌系统很少用于生产疫苗抗原。主要原因在于：首先，传统上认为糖基化对抗原功能很重要（Khan，2013年）。然而，最近的一项研究表明，去除一个糖基化位点可以增强针对SARS-CoV RBD的免疫反应（Chen等人，2014年），这一观点正在引起讨论。其次，在大肠杆菌中表达大蛋白并将其重新折叠成天然结构具有挑战性，尤其是对于含有多个二硫键的重组蛋白，这些蛋白需要重新折叠（Bessette等人，1999年；Bhatwa等人，2021年；Rathnayaka等人，2011年）。然而，最近改进的大肠杆菌菌株（如T7 SHuffle）使得能够表达具有多个二硫键的复杂小型到中型蛋白，并保持其天然构象（Lobstein等人，2012年）。

同时，蛋白质拆分策略有助于设计和生产能够重新折叠成与其全长蛋白结构相似或完全相同的小蛋白片段（Ebina等人，2011年）。在某些情况下，这些片段保留了功能或结合活性（Brindha等人，2022年；Wongnak等人，2024年）。迄今为止，随机选择的蛋白片段通常无法重新折叠成完整蛋白的天然结构。在先前的研究中，我们证明了登革病毒包膜蛋白的第三个结构域（ED3）在大肠杆菌中表达并适当重新折叠后，其结构在原子水平上与全长蛋白的晶体学研究结果几乎完全一致（Elahi等人，2014年），这体现了蛋白质拆分策略的潜力。

SARS-CoV-2是一种属于冠状病毒科的单链正链RNA病毒（V’kovski等人，2021年）。SARS-CoV-2的刺突蛋白是一种同源三聚体跨膜蛋白（图1a），它通过与人类血管紧张素转换酶2（ACE2）受体结合，在病毒进入宿主细胞过程中起关键作用（Lan等人，2020年）。受体结合域（RBD）是介导刺突蛋白与ACE2相互作用的关键区域，该区域体积小且易于生产（Brindha等人，2022年；Wongnak等人，2024年），使其成为疫苗开发的主要靶点（图1b）。事实上，由RBD诱导的抗体中有高达90%具有中和活病毒的能力（Letscher等人，2025年），并且保护作用已在免疫挑战实验中得到验证（Premkumar等人，2020年）。例如，抗RBD单克隆抗体已被证明可以在体内和体外阻止SARS-CoV-2感染（Dussupt等人，2021年）。

然而，在大肠杆菌表达的蛋白片段能够广泛用作疫苗候选物之前，仍有几个问题需要解决。除了前面提到的与二硫键形成和正确蛋白质折叠相关的挑战外，还有缺乏翻译后修饰（特别是糖基化，这被认为会影响抗原的免疫原性）。此外，小型重组蛋白通常免疫原性较低，通常需要佐剂、高剂量抗原以及长时间多次接种（Pollet等人，2021年）。佐剂在临床和实验环境中都被常规使用（Christensen，2016年），但其确切作用机制尚未完全明了，因此它们并不被视为首选解决方案。

为了解决这些问题，本研究使用了由大肠杆菌表达的受体结合域（RBD），我们之前已经证明它保持接近天然的结构，具有纳米摩尔级的ACE2结合亲和力（Wongnak等人，2024年），并且可以诱导中和抗体，尽管需要相对较高的剂量（每只小鼠30微克）。在本研究中，我们使用这种RBD作为模型蛋白片段，探讨了在大肠杆菌表达的RBD在较低浓度下是否仍然有效，并将抗RBD抗体反应与哺乳动物细胞表达的S1刺突蛋白进行了比较。值得注意的是，即使在大肠杆菌生产的RBD剂量仅为5微克且不添加佐剂的情况下，也能引发强烈的免疫反应并产生针对SARS-CoV-2 Omicron变体的中和抗体，而在相同条件下，哺乳动物表达的S1蛋白则未能达到这种效果。此外，我们评估了S1和RBD的七种不同配方（剂量），并一致观察到RBD的表现与S1蛋白相当或更好。这些结果强烈表明，即使不添加佐剂，大肠杆菌表达的Omicron RBD也是下一代COVID-19亚单位疫苗的有前景且成本效益高的候选抗原，同时也可能成为血清学检测的宝贵工具。

蛋白质表达、纯化和物理化学测量

如先前报道（Wongnak等人，2024年），含有SARS-CoV-2 Omicron BA.5 RBD序列的pET15b质粒被转入大肠杆菌T7 SHuffle细胞（New England Biolabs，马萨诸塞州伊普斯威奇）。蛋白质表达使用0.25 mM IPTG诱导，并在16°C下以125 rpm的速度培养16-18小时。细胞收获后（在4°C下以4000 rpm离心20分钟），然后用裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH8.8，150 mM NaCl）和裂解洗涤缓冲液（裂解缓冲液加上1% NP-40，0.1%）进行裂解。

Omicron BA.5 RBD的表达、纯化和生物物理特性

我们使用大肠杆菌T7 SHuffle菌株表达了SARS-CoV-2 Omicron BA.5变种的受体结合域（RBD）（图1），该菌株经过基因工程改造，以促进细胞质中正确的二硫键形成，这对于富含半胱氨酸的蛋白质（如RBD）的正确折叠至关重要。为了进一步提高折叠效率，我们采用了低温诱导方案，从而在表达过程中促进了正确的二硫键配对（Brindha等人，2022年；Wongnak等人）

讨论

疫苗接种是控制和减少传染病、防止全球数百万人死亡的有效手段。针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗已以前所未有的速度在全球范围内开发（Golob等人，2021年），但它们也有缺点，例如需要超低温冷链物流，这仍然是一个挑战（Oude Blenke等人，2023年）。此外，RNA疫苗将合成mRNA递送到宿主细胞中，偶尔可能会引发炎症和其他罕见不良反应。

结论

尽管基于大肠杆菌的表达系统存在一些常见问题，如缺乏真核生物的翻译后修饰（例如糖基化）、小型蛋白质的固有低免疫原性、潜在的脂多糖（LPS）污染以及蛋白质正确折叠的挑战，但我们的研究结果表明，由大肠杆菌表达的RBD作为一种多功能且成本效益高的抗原是可行的。值得注意的是，我们的研究表明受体结合域（RBD）

机构审查委员会声明

所有小鼠实验均按照日本动物实验法和东京农工大学的规定进行[批准编号R06-29]。

本文写作过程中未使用任何人工智能和人工智能辅助技术

作者贡献声明

M. Monirul Islam：撰写 – 审稿与编辑，数据分析。Yutaka Kuroda：撰写 – 审稿与编辑，初稿撰写，监督，资金获取，概念构思。Mami Oba：方法学，数据分析。Tetsuya Mizutani：方法学，数据分析。Rawiwan Wongnak：方法学，数据分析。Zelin Wang：撰写 – 审稿与编辑，初稿撰写，方法学，数据分析

未引用的参考文献

Baculovirus vs, ; COVID-19病例，2025年；Grant等人，2020年；Tu等人，2024年。

数据可用性

本研究生成或分析的所有数据均包含在文章及其补充信息文件中。

资助

本研究得到了全球创新研究所（GIR）和JST开放创新平台与企业研究所及学术界（OPERA）跨学科研究计划“救命早期诊断和预防技术”的支持，该计划由综合光子科学创建，并部分得到了Terumo基金会和日本畜牧业新技术协会的资助。

利益冲突声明

作者没有需要声明的利益冲突。

致谢：

我们感谢Patricia McGahan女士的英语校对，Md. Din Islam先生在小鼠实验中的帮助，以及Kuroda实验室的所有成员提供的技术建议和讨论。