烟曲霉（Aspergillus fumigatus）中Pseurotin A生物合成的机制学见解

《Small Structures》：Mechanistic Insights Into the Biosynthesis of Pseurotin A in Aspergillus fumigatus

　　摘要

pseurotin A是一种具有抗生素和免疫抑制特性的真菌代谢物，其生物合成涉及一组酶，包括多酮非核糖体肽合成酶（PKS-NRPS）、PsoA和一种双功能酶PsoF。PsoA由一个高还原性的多酮合成酶（HR-PKS）和一个非核糖体肽合成酶（NRPS）模块组成。然而，关于PsoA和PsoF在pseurotin A生物合成中的分子机制知之甚少。在这里，我们报告了来自烟曲霉（Aspergillus fumigatus）的PsoA的PKS模块在无辅因子状态以及与辅因子复合物状态下的冷冻电镜（cryo-EM）结构，揭示了与哺乳动物脂肪酸合成酶相似的保守PKS结构。有趣的是，在酮合成酶（KS）结构域的活性位点中发现了一个灵活的基序，该基序通过调节活性位点的大小来控制目标化合物的生成。我们还发现了PsoA和PsoF之间的直接相互作用，并绘制了它们的接触区域。我们的发现为pseurotin A的生物合成和PKS-NRPS酶的分子机制提供了新的见解。

1 引言

细菌和真菌产生大量的生物活性次级代谢物，构成了具有巨大制药和工业潜力的广泛分子库[1, 2]。多酮和非核糖体肽是这些次级代谢物的两大类，它们分别由PKS（多酮合成酶）、NRPS（非核糖体肽合成酶）和PKS-NRPS混合酶合成[3-5]。之前对单个PKS或NRPS的结构研究增强了我们对这些酶的理解[6-9]。尽管之前的研究已经确定了PKS-NRPS混合酶中的关键结构域，但我们对它们完整结构和综合分子机制的了解仍然有限[10, 11]，这阻碍了对其功能的全面理解。Pseurotin A是烟曲霉和其他真菌的次级代谢物，具有广泛的生物活性，例如作为几丁质合成酶的竞争性抑制剂、B细胞增殖的抑制剂以及IgE产生的抑制剂[12]。在烟曲霉中，pseurotin A的生物合成依赖于至少七个基因组成的超簇[13, 14]，包括一个PKS-NRPS PsoA和一个双功能酶PsoF（图1a）。PsoA的N端PKS部分是一个保守的I型高还原性PKS（HR-PKS），其结构域构型为KS-MAT-DH-ψCMT-KR-ACP（KS：酮合成酶；MAT：丙二酰-乙酰转移酶；DH：脱水酶；CMT：甲基转移酶；KR：酮酰还原酶；ACP：酰基载体蛋白），而C端的NRPS模块由四个结构域组成，构型为C-A-T-R（C：缩合结构域；A：腺苷酰化结构域；T：硫醇化结构域；R：还原酶结构域）（图1b）。PsoA-PKS的结构域构型是使用其AlphaFold2预测的结构并与脂肪酸合成酶（FAS）进行结构比较得出的[15-17]。PsoF是一种双功能酶，具有两个不同的催化中心，包括一个CMT和一个含有FAD的单加氧酶（FMO）结构域（图1c）[18]。

2 结果

2.1 PsoA和PsoF之间的直接相互作用

根据之前的研究，我们通过共表达PsoA、PsoF和PsoB在S. cerevisiae菌株BY4742-NpgA中重新构建了azaspirene的生物合成过程[20]。LCMS分析证实了酵母培养物中产生了azaspirene（图1e, 2a）。在构建的基因中，全长PsoA基因被整合到带有C端FLAG标签的pRS423中。通过使用抗FLAG树脂进行免疫沉淀实验，确认了PsoA在工程菌株中的成功表达（图S1a）。有趣的是，在共免疫沉淀样本中检测到一个额外的蛋白质条带，进一步的蛋白质质谱分析鉴定出这是PsoF，表明PsoF和PsoA之间存在直接相互作用（图S1a）。

2.2 PsoA–PsoF复合物的冷冻电镜分析

我们对纯化的PsoA–PsoF复合物进行了单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）分析，并确定了该复合物在无辅因子状态下的三维结构（图S1e和S3a）。颗粒分布分析显示，65.8%的颗粒呈现只有PsoA的KS-MAT-DH的构型（PsoA-PKS-I），而剩余的34.2%呈现更均匀的构型，其中包含有序的KS-MAT-DH-ψCMT-KR（PsoA-PKS-II）（图3a和S3a）。不幸的是，由于它们的流动性，PsoA的ACP和NRPS模块以及PsoF在结构中无法被分辨出来。

2.3 PsoA–PsoF复合物的冷冻电镜分析

我们对纯化的PsoA–PsoF复合物进行了单颗粒冷冻电镜分析，并确定了该复合物在无辅因子状态下的三维结构。我们的冷冻电镜数据集经过3D分类后得到了两个主要的构象类别。颗粒分布分析显示，65.8%的颗粒呈现只有PsoA的KS-MAT-DH的构型（PsoA-PKS-I），而剩余的34.2%呈现包含有序的KS-MAT-DH-ψCMT-KR的构型（PsoA-PKS-II）（图3a和S3a）。然而，PsoA的ACP和NRPS模块以及PsoF在结构中无法被分辨出来。序列比对显示，这些残基在不同MAT蛋白中高度保守，表明它们在酰基转移过程中起着关键作用（图S7a）；R767、R770和R891位于结合口袋的边缘，稳定了丙二酰-CoA的CoA部分。此外，MAT结构域在无辅因子和结合丙二酰-CoA状态下的超级叠加显示，口袋的左侧α螺旋和β链在辅因子结合后向内移动了3 ?，使得结合口袋更加紧凑（图4d）。有趣的是，将我们的结构与其他报道的结合丙二酰-CoA的结构进行比较后发现，丙二酰-CoA在PsoA的MAT域上的结合方式与在小鼠FASN和大肠杆菌Malonyl-CoA-酰基载体蛋白transacylaseFabD中观察到的方式有显著不同。具体来说，CoA分子的腺苷部分在PsoA中的取向与在mFASN和FabD中的取向相反，而丙二酰-CoA分子的其他部分几乎相同（图4e，S6b）。尽管这种差异的功能意义尚不清楚，但我们注意到PsoA的MAT域中与腺苷相互作用的残基在主要的真菌PKS中是保守的，但与哺乳动物和原核生物的PKS不同（图S7a）。因此，CoA结合方式的差异可能是由于生物进化多样性造成的。先前的研究表明PsoA使用丙酰-CoA作为起始单元，这与其他已知的PKS-NRPS使用的丙二酰-CoA不同[19]。为了了解PsoA的MAT如何选择不同的CoA单元，我们进行了MST测定，以确定PsoA对丙二酰-CoA和丙酰-CoA的结合亲和力。结果显示，PsoA可以结合丙二酰-CoA和丙酰-CoA，但对丙二酰-CoA的结合亲和力更强，Kd约为0.93 μM，而对丙酰-CoA的结合亲和力约为1.98 μM（图S8）。这表明一旦MAT结合了丙酰-CoA来启动聚酮酸合成，后续反应中MAT将优先选择丙二酰-CoA来延长产物链。目前尚不清楚为什么PsoA使用丙酰-CoA作为起始单元。由于丙二酰-CoA是多种化合物（包括脂质、有机酸和聚酮酸）生物合成的核心前体，其细胞内的浓度很高且受到严格调控[26]。相比之下，丙酰-CoA的浓度相对较低，因为其在细胞内积累时会产生毒性作用[27]。这与pseurotin A的毒性作用一致，后者竞争性地抑制了真菌几丁质合成酶[28]。因此，PsoA使用丙酰-CoA作为起始单元可能有助于将pseurotin A的产生保持在相对较低的水平，并且可以通过丙酰-CoA的合成来调节。PsoA的KR结构域的折叠与其他短链脱氢酶/还原酶（SDR）家族的成员非常相似（图S6c）[29, 30]。在我们的结构中，NADPH的腺嘌呤碱基、核糖环和磷酸基团与辅因子的电子密度很好地匹配，而与烟酰胺环对应的密度相对较弱，表明其具有灵活性（图S6d）。由于烟酰胺基团在氧化还原反应中负责提供电子和氢原子，因此这一基团的灵活性对于NADPH作为辅酶的功能至关重要。KR的催化口袋由一组极性残基组成，如R2162和H2163，它们与腺嘌呤基团相互作用，R2312稳定核糖环（图4f）。根据烟酰胺环的假定结合姿势，我们推测S2263、Q2273和Y2276对KR的活性至关重要。这一假设得到了这些残基在同源蛋白质序列中的高度保守性的支持（图S7b）。此外，M2217位于口袋的中心区域，它与NADPH的核糖环相互作用，稳定了核糖和磷酸基团（图S6e）。

2.4 KS结构域活性位点的动态

PsoA的KS结构域是进行酰基和丙二酰基块的脱羧Claisen缩合以延长聚酮酸链的关键结构域。它采用了与其他PKS蛋白中相同的保守结构折叠（图S9a,d）[8, 9, 21, 31]。然而，与各种PKS蛋白的结构比对显示，PsoA在无辅因子状态下的KS活性位点呈现出独特的构象（图S9b）。在其他PKS中KS结构域活性位点的一个短螺旋在PsoA的无辅因子状态下变成了一个环（M152-S157）（图S9c）。与其他PKS相比，PsoA无辅因子状态下的这个环向左移动，导致KS活性位点口袋显著收缩（图5a和S9b,c）。因此，我们将PsoA无辅因子状态下的活性位点称为“闭合”构象，而其他PKS的活性位点称为“开放”构象。有趣的是，对无辅因子和结合辅因子的PsoA进行结构比较后发现，结合辅因子的PsoA的KS活性位点处于开放构象，因为M152-S157段形成了类似其他PKS的短螺旋[8, 9, 21, 31]。这表明与辅因子的孵育诱导了KS活性位点的重排。图5：KS结构域活性位点的动态环。（a）PsoA-KS结构域在开放和闭合状态下的动态环（M152-S157）。（b）PsoA在开放状态下的KS结构域与PKS13的结合底物状态下的KS结构域之间的结构比对。（c）PsoA在闭合状态下的KS结构域与PKS13的结合底物状态下的KS结构域之间的结构比对。闭合状态下的KS结构域活性位点可以容纳大约9个碳原子的脂肪酸。（d）PsoA在开放/闭合状态下的KS结构域与DEBS-M3（EryA3）的ACP结合状态下的KS结构域之间的结构比对。（e）对重组PsoA突变体（M152A、I153A、T156A、S157A）在S. cerevisiae中的LC-MS分析。为了揭示这个环如何影响KS结构域的功能，我们通过将PsoA的结构与结合底物的PKS13和ACP结合的DEBS M3的结构进行叠加，将底物和Ppant连接到PsoA-KS结构域的活性位点（图5b–d）[8, 31]。结构分析显示，无辅因子状态下PsoA-KS的活性位点在闭合构象下可以很好地容纳ACP的Ppant基团，但在空间上与PKS13中观察到的产物发生冲突（图5c,d）。进一步详细分析表明，该腔体只能容纳一个9个碳原子的聚酮酸产物，这与PsoA接受PsoF转移的甲基基团时的中间产物长度一致（图1d）[18, 32]。我们假设这个环的存在可能在促进PsoA底物向催化阶段的过渡中起重要作用。

3 讨论

PKS-NRPS混合酶在真菌界中广泛分布，它们催化了许多具有显著治疗潜力的次级代谢物的生物合成。本工作中的结构比较分析显示，PsoA-PKS与人类FASN和LovB（洛伐他汀非酮酸合成酶）具有高度相似性。我们还发现，PSO基因簇中的PsoF以“转录”方式直接与PsoA相互作用，从而参与生物合成途径。在PKS中经常观察到转录因子的参与，尽管大多数情况下是转酰基转移酶[33]。LovB的功能活性需要转录作用的烯酰还原酶LovC，且LovB与LovC之间的直接物理相互作用已经通过实验得到证实[21, 34]。然而，与LovB-LovC等典型的转录相互作用不同，PsoF并不直接与PsoA-PKS相互作用，而是与PsoA-NRPS相互作用。我们进一步的实验发现表明，PsoA与PsoF之间的相互作用具体发生在NRPS模块的C结构域和FMO结构域之间，这种相互作用模式在类似的背景下已有报道[35]。此外，C结构域在结构上靠近PKS模块的ACP结构域。通过将其氧化酶结构域与PsoA-NRPS模块连接起来，PsoF促进了ACP与MT结构域的对接，从而实现了生物合成中间体的高效和及时甲基化。之前的PKS-NRPS混合体结构研究仅限于非还原性PKS模块，例如colibactin生物合成中的PKS-NRPS，Clbk（图S11a,b）[36]。我们的工作展示了PsoA-PKS的结构，这是一种保守的I型高还原性PKS，为这一酶学上不同的类别提供了新的见解。ClbK-PKS与PsoA-PKS之间的结构比较显示，它们的KS结构域在整体上具有高度相似性（图S11c）。然而，与PsoA-PKS不同，ClbK-PKS只有扩展模块，并且其结构显示KS结构域在其侧面和底部有两个底物入口（图S11a–c）。ClbK和PsoA都属于连接的PKS-NRPShybrid系统，但两者都没有获得完整的PKS-NRPS界面全长结构。这可能反映了模块间缺乏强相互作用，连接主要通过肽连接器实现。PsoA-PKS的整体构象类似于后生动物脂肪酸合成酶和高度还原的迭代型I型聚酮酸合成酶，而ClbK-PKS与其他属于trans-PKS家族的酶具有高度的结构同源性，表明PKS-NRPS混合酶和单个PKS之间存在结构保守性。鉴于PKS-NRPS混合体在天然产物生物合成基因簇中的普遍性，这种连接的混合体架构可能代表了一种进化上的经济策略，使得相邻的PKS和NRPS模块能够在同一装配线上协调调节。在我们的手稿中，两个冷冻电镜数据集产生了两个不同的图谱，PKS-I和PKS-II。在PsoA-PKS-I中，只有PsoA-PKS的KS-MAT-DH可见，表明PsoA-PKS的其他部分具有高度灵活性。相比之下，PsoA-PKS-II中的几乎所有结构域（KS-MAT-DH-ψCMT-ψKR-ψER-KR）都是有序的。之前对FASN的研究一致表明，其功能循环涉及修饰单元和延长单元相对于摆动ACP结构域的协调运动，后者在活性位点之间穿梭反应中间体[15, 16]。基于为FASN建立的机制范式，我们提出PsoA可能也具有类似的催化机制，即修饰模块相对于扩展模块在不同结构域上的相对移动。PsoA-PKS-II构象可能代表一个反应中间状态，而PsoA-PKS-I构象被认为包含了PsoA在催化循环不同阶段的其他催化活性状态。除了PsoA与hFASN之间的相似性外，PsoA的动态性低于hFASN，因为KS和DH结构域之间的接口处有一个独特的短螺旋（图3f）。我们注意到PsoA中的ER结构域在PsoA中是不活跃的，但在hFASN中是活跃的。这表明PsoA的ACP结构域需要移动的距离比hFASN短，这可能解释了为什么PsoA的修饰模块更加有序。此外，PsoA的修饰模块的灵活性也可能来源于PsoA中相邻NRPS结构域的固有结构可塑性，这可能在整个连接的PKS修饰区域传播和放大构象变异性。辅因子结合增加了采用PsoA-PKS-II构象的颗粒比例。这与辅因子作为“分子订书钉”的已知作用一致，它们减少了构象熵，预组织了活性位点，并通过刚性化提高了催化效率[37, 38]。此外，在KS活性位点捕获了一个独特的环，该环在两种不同的构象中被发现，并被认为参与控制聚酮酸产物的链长度和甲基化位点。先前的研究表明，KS结构域是控制聚酮酸产物链长度的关键决定因素，这由KS底物口袋的大小控制[39-41]。此外，证据表明KS结构域还影响聚酮酸产物的甲基化模式[40]。在我们的研究中，PsoA-PKS的KS结构域中发现的动态环赋予了KS活性位点一定的结构可塑性，相应的口袋大小与聚酮产物的长度和底物甲基化位点一致。这些功能属性的保守性增强了我们对动态环在PsoA-PKS中作用的推断的合理性。综合这些发现，我们获得了关于pseurotin A生物合成机制的见解。然而，pseurotin A的详细生物合成机制仍然不清楚，例如ACP在PsoA模块之间的穿梭、PsoA的PKS和NRPS模块之间的协作以及其他PSO酶的机制。捕捉PsoA在不同构象下的结构以及其他酶的结构将有助于完全揭示这些机制。

4 方法

4.1 在酵母中异源生产Azaspirene及其中间体

为了生成BY4742-NpgA菌株，将ADE2基因的开放阅读框（ORF）替换为npgA基因的ORF。psoA基因被克隆到pRS423载体中，psoF和psoB基因被克隆到pRS426载体中。具体来说，psoB基因被插入到一个包含GAL1启动子和ADH1终止子的表达盒中，该表达盒已经预先组装在plasmid pFA6a上（标记为pFA6a GAL1）。随后，携带psoB的完整GAL1 ADH1表达盒被插入到pRS426-psoF的T3启动子上游，以生成最终的双重表达构建体。为了构建PsoA突变体，在每个突变位点的3′端引入了一个共同的下游序列，突变位点本身作为5′参考，以指导突变DNA序列的组装。构建过程中使用的寡核苷酸列在表S2中。实验中使用的质粒列在表S3中。BY4742-NpgA菌株随后用这些构建体转化，并在缺乏尿嘧啶和组氨酸的最小培养基上选择3天。葡萄糖（2%，w/v）作为唯一的碳源。获得的转化体在含有半乳糖作为唯一碳源的相同最小培养基中诱导48小时。培养上清液用等体积的乙酸乙酯提取两次。合并的有机提取物被浓缩并重新溶解在100 μL甲醇中，用于LC MS分析。LCMS分析使用Thermo Scientific Vanquish-F UHPLC系统和Thermo Scientific Q-Exactive HF-X质谱仪进行。样品在5–95% CH3CN（v/v）的线性梯度中分离，H2O中添加0.05%（v/v）甲酸，流速为0.1 mL/min。

4.2 交联质谱

交联使用BS3以50:1的摩尔比（交联剂：蛋白质）进行。在指定时间点收集交联的PsoA–PsoF复合物的样品，并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分析。交联复合物被切割，用胰蛋白酶在凝胶中消化，然后提取肽进行LC-MS/MS分析。色谱分离使用C18毛细管柱，以90分钟的乙腈梯度进行。MS数据在Orbitrap Fusion Lumos上以数据依赖模式获取。前体离子（m/z 350–1600）以60,000的分辨率扫描，选定的离子（z = 3–7）通过HCD（30% NCE）片段化，片段检测分辨率为15,000。使用pLink 3.0根据PsoA和PsoF序列的数据库鉴定交联肽。将氨基甲酰甲基（Cys）设置为静态修饰，将氧化（Met）设置为可变修饰。选择BS3作为交联剂，对赖氨酸残基具有特异性。前体离子的质量容忍度为10 ppm，片段离子的质量容忍度为0.02 Da。交联鉴定的假发现率（FDR）使用目标-诱饵方法估计，并在光谱匹配水平上控制在≤1%。

4.3 PsoA–PsoF复合物的表达和纯化

转化的酵母菌株BY4742在合成组氨酸-尿嘧啶缺失培养基（SD-His-Ura）中培养约20小时，然后转移到YPG培养基（每升10克酵母提取物、20克蛋白胨和20克D-半乳糖）中培养12小时，之后收获。细胞重新悬浮在裂解缓冲液中（10%甘油、20 mM Hepes-NaOH（pH 7.4）、500 mM NaCl、1 mM MgCl2和1 mM MnCl2），然后用French press在15,000 psi下裂解。我们在4°C下以10,000 g离心裂解液30分钟。我们将上清液加载到预平衡的抗-FLAG亲和柱（GenScript，L00907）中，并用裂解缓冲液洗涤亲和树脂。蛋白质用含有3×FLAG肽（0.15 mg/ml）的裂解缓冲液洗脱，并进一步在Superose 6 10/300 Increase凝胶过滤柱中纯化，缓冲液A为[20 mM Hepes-NaOH（pH 7.4）、150 mM NaCl和1 mM MgCl2]。纯化的蛋白质通过SDS-PAGE评估并浓缩，用于冷冻电镜（cryo-EM）分析。

4.4 冷冻电镜

将约2.8 mg/ml浓度的PsoA-PsoF样品（2.5 μl）放置在发光放电的多孔碳网格（quantifoil Cu R1.2/1.3，300 mesh）上，并使用FEI Vitrobot Mark IV在液氮中快速冷冻。所有冷冻电镜数据都在FEI Talos Glacios2显微镜（Thermo Fisher）上收集。为了制备PsoA–PsoF和辅因子复合物，纯化的PsoA–PsoF蛋白样品补充了丙二酰-CoA（1 mM）、丙酸-CoA（0.1 mM）、NADPH（1 mM）和SAM（1 mM）。混合物在冰上孵育30分钟，然后准备网格。

4.5 PsoF-CMT和PsoF-FMO的表达和纯化

编码PsoF-CMT和PsoF-FMO的cDNA被克隆到带有N末端6×His标签的pET28a载体中。表达质粒pET28a用于转化E. coli BL21(DE3)感受态细胞。来自单个菌落的转化体用于接种20 mL含有50 mg/L卡那霉素的Luria-Bertani（LB）培养基，并在37°C（220 rpm）下过夜培养。每个1 L含有抗生素的LB培养基接种2 mL过夜种子培养物，并在37°C（220 rpm）下培养，直到OD600达到约0.4–0.8。细胞在冰浴中冷却20分钟，然后加入0.2 mM IPTG，并在18°C（220 rpm）下继续培养18–20小时。细胞重新悬浮在裂解缓冲液中（10%甘油、20 mM Hepes-NaOH（pH 7.4）、500 mM NaCl、1 mM MgCl2、1 mM MnCl2和1 mM PMSF），然后用French press在12,000 psi下裂解。我们在4°C下以10,000 g离心裂解液30分钟。我们将上清液加载到预平衡的抗-FLAG亲和柱（GenScript，L00907）中，并用裂解缓冲液洗涤亲和树脂。蛋白质用含有3×FLAG肽（0.15 mg/ml）的裂解缓冲液洗脱，并进一步在Superose 6 10/300 Increase凝胶过滤柱中纯化，缓冲液A为[20 mM Hepes-NaOH（pH 7.4）、150 mM NaCl和1 mM MgCl2]。纯化的蛋白质通过SDS-PAGE评估并浓缩，用于冷冻电镜分析。

4.6 冷冻电镜

将PsoA-PsoF样品（2.5 μl）放置在发光放电的多孔碳网格上（quantifoil Cu R1.2/1.3，300 mesh），并在液氮中使用FEI Vitrobot Mark IV快速冷冻。所有冷冻电镜数据都在FEI Talos Glacios2显微镜（Thermo Fisher）上收集。为了制备PsoA–PsoF和辅因子复合物，纯化的PsoA–PsoF蛋白样品补充了丙二酰-CoA（1 mM）、丙酸-CoA（0.1 mM）、NADPH（1 mM）和SAM（1 mM）。混合物在冰上孵育30分钟，然后准备网格。

4.5 PsoF-CMT和PsoF-FMO的表达和纯化

编码PsoF-CMT和PsoF-FMO的cDNA被克隆到带有N末端6×His标签的pET28a载体中。表达质粒pET28a用于转化E. coli BL21(DE3)感受态细胞。来自单个菌落的转化体用于接种20 mL含有50 mg/L卡那霉素的Luria-Bertani（LB）培养基，并在37°C（220 rpm）下过夜培养。每个1 L含有抗生素的LB培养基接种2 mL过夜种子培养物，并在37°C（220 rpm）下培养，直到OD600达到约0.4–0.8。细胞在冰浴中冷却20分钟，然后加入0.2 mM IPTG，并在18°C（220 rpm）下继续培养18–20小时。细胞重新悬浮在裂解缓冲液中（10%甘油、20 mM Hepes-NaOH（pH 7.4）、500 mM NaCl、1 mM MgCl2、1 mM MnCl2和1 mM PMSF和20 mM咪唑），然后用French press在12,000 psi下裂解。我们在4°C下以8000 g离心裂解液30分钟。上清液应用于Ni-NTA树脂（sangon Biotech（上海）目录号C600033?0100；每50 mL渗透冲击体积1 mL树脂），在洗涤缓冲液1（10%甘油、20 mM Hepes-NaOH（pH 7.4）、500 mM NaCl、1 mM MgCl2、1 mM MnCl2、20 mM咪唑）中预平衡，并在500 mL烧杯中缓慢搅拌1小时。浆液加入Kimble-Kontes Flex柱并通过重力洗脱。树脂用100 mL洗涤缓冲液2（10%甘油、20 mM Hepes-NaOH（pH 7.4）、500 mM NaCl、1 mM MgCl2、1 mM MnCl2、40 mM咪唑）洗涤，然后用50 mL洗脱缓冲液（10%甘油、20 mM Hepes-NaOH（pH 7.4）、500 mM NaCl、1 mM MgCl2、1 mM MnCl2、40 mM咪唑）洗脱Ni结合的蛋白质。洗脱的蛋白质用Amicon Ultra Centrifugal Filters（Millipore Sigma）浓缩至≤2 mL。Ni-NTA纯化的蛋白质洗脱液进一步在Superdex 200 Increase 10/300凝胶过滤柱中纯化，缓冲液A为[20 mM Hepes-NaOH（pH 7.4）、150 mM NaCl和1 mM MgCl2]。纯化的蛋白质通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳评估，并在液氮中快速冷冻以保存在-80°C。

4.6 拉下试验

纯化的PsoF-CMT（或PsoF-FMO）与Flag-PsoA一起或在总体积为100 μL的缓冲液A（20 mM Hepes-NaOH（pH 7.4）、150 mM NaCl和1 mM MgCl2）中在旋转器上孵育30–60分钟。抗-Flag亲和树脂通过用相同冷却缓冲液洗涤三次制备，然后短暂离心以沉淀珠子。预清蛋白混合物然后加入平衡的树脂中，并在4°C下旋转孵育2–4小时，以允许免疫捕获Flag-PsoA及其相关结合伴侣。孵育后，通过离心沉淀树脂，并用0.5 mL冷却的Binding/Wash Buffer洗涤三次以去除非特异性结合的蛋白质。然后通过用含有3×FLAG肽（0.15 mg/ml）的缓冲液孵育珠子来洗脱结合的蛋白质复合物。最终通过离心收集洗脱液，并通过SDS-PAGE分析。

4.7 冷冻电镜图像处理

我们使用MotionCorr-2.0进行运动校正，使用CTFFIND-4.1计算对比度传递函数参数。我们使用CryoSPARC进行所有剩余步骤（粒子挑选和提取、两轮2D分类、一轮从头算重建、一轮非均匀精修和一轮非均匀精修）。通过金标准傅里叶壳层相关性估计地图的分辨率，相关截止值为0.143。

4.8 结构建模、精修和验证

我们使用Alphafold2预测的PsoA结构作为初始模型，将其拟合到我们的地图中，并在Coot和ChimeraX中对其进行校正。完整的PsoA模型通过在Phenix程序中进行实空间精修，随后在Coot中手动调整。最后，使用MolProbity验证模型。所有模型的分析和可视化都使用ChimeraX完成，包括计算埋藏溶剂可及表面积、相互作用和均方根偏差。

支持信息

额外的支持信息可以在支持信息部分在线找到。支持图S1：PsoA-PsoF复合物的纯化和结构。a-d 通过SDS-PAGE和Coomassie Blue染色分析蛋白质纯化。纯化的样品包括PsoA-PsoF复合物、PsoA-PKS、PsoA-NRPS和PsoF蛋白质。e 在Superose 6柱上的尺寸排阻色谱中，PsoA-PsoF复合物作为峰值洗脱。f 代表PsoA的多个视图的2D类别。g PsoA的假定烯酰还原酶（ER）域与Candida tropicalis（烯酰-[酰基-载体-蛋白质]还原酶1、Homo sapiens（线粒体烯酰-[酰基-载体-蛋白质]还原酶MECR）和大肠杆菌（烯酰-[酰基-载体-蛋白质]还原酶FabL）的代表性ER酶的序列比对。支持图S2：PsoF的FMO和CMT域与PsoA-NRPS的拉下试验。纯化输入蛋白质的SDS-PAGE（泳道2、4、7和9）和通过3*flag肽从FLAG亲和柱洗脱的样品（泳道3、5、8和10）。泳道1和6显示分子质量标记。PsoA-NRPS与flag标签混合后与纯化的FMO或PsoF的CMT域一起加载到亲和柱中（泳道2-3和7-8）。泳道4-5和9-10仅加载PsoF域作为阴性对照。支持图S3：PsoA-PsoFin apo状态的冷冻电镜数据处理和分辨率估计。a PsoA apo状态灵活类别的两个独立半3D地图的金标准傅里叶壳层相关性。b 用于CryoSPARC 3D重建PsoA apo状态灵活类别的2.99-? 3D地图的原始粒子角度分布。c 用于CryoSPARC 3D重建PsoA apo状态均匀类别的2.99-? 3D地图的原始粒子角度分布。d 用于CryoSPARC 3D重建PsoA apo状态均匀类别的3.39-? 3D地图的原始粒子角度分布。e 用于CryoSPARC 3D重建PsoA apo状态均匀类别的3.39-? 3D地图的局部分辨率图。支持图S4：修饰模块的原子模型。a 修饰模块的总体结构。b 反应室通过扩展和修饰模块的协调作用组装。支持图S5：PsoA-PsoFin辅因子（丙二酰-CoA、NADPH）结合状态的冷冻电镜数据处理和分辨率估计。a PsoA底物结合灵活类别的两个独立半3D地图的金标准傅里叶壳层相关性。b 用于CryoSPARC 3D重建PsoA底物结合灵活类别的2.16-? 3D地图的原始粒子角度分布。c 用于CryoSPARC 3D重建PsoA底物结合均匀类别的3.36-? 3D地图的原始粒子角度分布。d 用于CryoSPARC 3D重建PsoA底物结合均匀类别的3.36-? 3D地图的局部分辨率图。e 用于CryoSPARC 3D重建PsoA底物结合均匀类别的3.36-? 3D地图的局部分辨率图。支持图S6：PsoA催化结构域与其同源物的序列和结构比较。a. 马洛尼酰-CoA的电子密度以网格形式显示，其结构用棍状图表示。b. PsoA底物结合的MAT结构域（粉色）与FabD底物结合的MAT结构域（浅海绿色）之间的结构对齐。c. KR结构域（紫色）与其同源物之间的结构对齐。d. NADPH的电子密度以网格形式显示，其结构用棍状图表示，并标出了相应的化学基团。e. M2217通过与NADPH的核糖基团的特异性相互作用来稳定NADPH。支持图S7：PsoA催化结构域与其同源物的序列比较。a. MAT结构域与同源蛋白的序列对齐，包括洛伐他汀非酮体合成酶（LovB，Aspergillus terreus）、红霉素内酯合成酶模块1（EryA1/DEBS_M1，Saccharopolyspora erythraea）、脂肪酸合成酶（hFASN，Homo sapiens）和马洛尼酰-CoA酰基载体蛋白转酰酶（FabD，Escherichia coli）。b. KR结构域与Aspergillus terreus（LovB）、Homo sapiens（hFASN）和Saccharopolyspora erythraea（DEBS_M1）的同源物的序列对齐。支持图S8：MST介导的PsoA与马洛尼酰-CoA（a）或丙酰-CoA（b）之间的相互作用。支持图S9：PsoA KS结构域与其同源KS结构域的结构比较。a. 关闭状态的PsoA KS结构域（紫色）与不同颜色的同源KS结构域的叠加图。b. 放大视图，突出显示对齐的KS结构域的不同构象。c. 两种状态下KS环的密度图。d. KS结构域与关键同源蛋白的序列对齐，包括LovB、EryA1/DEBS_M1、Lsd14（Streptomyces lasalocidi）、Pks13（Mycobacterium tuberculosis）和hFASN。支持图S10：菌株中PsoA和PsoF的Western blot分析。使用抗-flag抗体检测C末端带有FLAG标签的PsoA，使用抗-His抗体检测C末端带有His标签的PsoF。支持图S11：ClbK-PKS与PsoA-PKS结构域的比较。a. ClbK的模块化结构。b. ClbK-PKS二聚体的整体结构。KS结构域的两个底物结合位点用绿色椭圆标出。c. ClbK-PKS与PsoA-PKS的叠加图（灰色）。支持表S1：冷冻电镜数据收集、精修和验证。支持表S2：本研究中使用的寡核苷酸。支持表S3：本研究中使用的质粒。作者贡献

Lei Sun：研究（负责人）、方法学（负责人）、验证（负责人）、可视化（负责人）、撰写——初稿（负责人）、撰写——审阅和编辑（协助）。Zi-Long You：研究（协助）、方法学（协助）。Rui-Qing Lyu：研究（协助）。Zhao-Bin Wang：研究（协助）。Ming Ma：方法学（协助）、项目管理（协助）。Lin Bai：形式分析（负责人）、资金获取（负责人）、项目管理（负责人）、监督（负责人）、验证（负责人）、可视化（协助）、撰写——初稿（协助）、撰写——审阅和编辑（负责人）。致谢

冷冻电镜数据是在北京大学健康科学中心冷冻电镜设施中收集的。感谢Dandan Chen和Lihong Chen在数据收集方面的协助。感谢北京大学分析仪器中心在LCMS数据收集方面的支持，以及Zhou Wen博士在交联质谱（CLMS）数据采集和分析方面的帮助。本工作得到了国家自然科学基金（32571451和92578126，针对Lin Bai）、北京市自然科学基金（7252080，针对Lin Bai）和北京大学（针对Lin Bai）的资助。

本工作得到了国家自然科学基金（32571451、92578126）和北京市自然科学基金（7252080）的资助。利益冲突

作者声明没有利益冲突。数据可用性声明

PsoA-PsoF复合物的冷冻电镜3D图谱及其相应的原子模型已存入EMDB数据库和RCSB PDB，相应的访问代码分别为EMD-66474和9X29、EMD-66475和9X2A、EMD-66476和9X2B、EMD-66477和9X2C。