高灵敏度的正电子成像技术揭示了蚂蚁群体中食物的短期分布模式

《Scientific Reports》：Highly sensitive positron imaging reveals short-term food distribution patterns in ant groups

　　摘要
研究蚂蚁群体中的食物分配对于探究社会行为至关重要，它为资源分配、群体动态和环境适应提供了宝贵的见解，从而推动了生态学研究的发展。在这项工作中，我们开发了一种高度敏感且定量的实验工具，利用正电子发射放射性核素和辐射成像系统来可视化蚂蚁群体内部食物分配随时间的变化。通过对一个包含100只蚂蚁的群体进行观察，我们能够量化3小时内食物分配分散指数的变化。通过使用伽马计数器进行的传统量化方法的结果进行交叉验证，确认了该方法的准确性。此外，我们还成功地对一个包含12只蚂蚁的群体进行了食物分配的可视化，并量化了30分钟内的食物交换量。这种方法可以用来阐明控制食物分配的机制。

引言
长期以来，人们认为营养交换在社会性昆虫（如蚂蚁、蜜蜂和白蚁）群体功能整合的进化过程中发挥了重要作用1，并且最近再次受到了关注2,3。作为理解群体内部营养流动动态的第一步，在20世纪50至70年代，人们积极开展了使用放射性标记食物的可视化实验（参见4,5）。由于当时的技术限制，这些研究只能获得“快照”数据，即在喂食后固定时间间隔监测群体成员的放射性。在蚂蚁研究中，最近的研究集中在口对口（trophallactic）营养交换上，并开发了几种实时监测个体间营养转移的方法。一些研究使用荧光液体食物来追踪蚂蚁从开始采集食物到吃饱的过程6,7,8,9,10,11。然而，尽管可以获得一定程度的量化，但很难准确测量蚂蚁持有的食物量。Buffin等人开发了一种使用放射性同位素（99mTc）和伽马相机来可视化食物交换的方法12。然而，这种方法无法可视化并量化单个蚂蚁的食物交换情况，因为伽马相机的分辨率有限。

正电子成像也使用放射性同位素，其中最广泛使用的技术是用于癌症筛查的正电子发射断层扫描（PET）。正电子成像系统能够同时测量511 keV的湮灭伽马射线，分辨率约为2毫米，从而实现非侵入性和高灵敏度的食物交换可视化。然而，大多数用于医学研究的正电子发射放射性核素的半衰期很短（例如，18F：110分钟，11C：20分钟），必须使用回旋加速器来生产；因此，能够进行正电子成像的设施很少13。

我们之前使用平面正电子成像系统PETIS（正电子发射示踪剂成像系统）14,15来可视化植物中元素的移动。我们使用22Na（半衰期T1/2 = 2.6年）这种商业上可获得的长半衰期正电子发射放射性核素来可视化钠的运输16。然后我们认为这种22Na正电子成像技术不仅可以用于植物研究，也可以用于蚂蚁群体的研究。在这里，我们开发了一个实验系统，使用22Na标记的食物（蔗糖）和PETIS来可视化蚂蚁群体食物分配的实时定量变化。

结果
在一个大型蚂蚁群体中，喂食一只工蚁大约500 kBq的22Na标记食物（30%蔗糖溶液）后（图1A），将这只蚂蚁（最初被喂食的蚂蚁）放入一个包含大约100只工蚁的容器中，然后将该容器放置在PETIS探测器的中间，以可视化个体间22Na标记诱饵的交换（图1B）。我们在三个不同的生物学重复实验（Exp1、Exp2和Exp3）中成功可视化了蚂蚁群体内部食物分配的时间变化过程。在整个实验过程中，实验组仅由工蚁组成，没有蚁后或幼虫（这与包含蚁后和幼虫的“种群”不同）。电影S1的顶部面板显示了Exp1、Exp2和Exp3中食物分配的动画。图1C显示了电影S1左上角面板的快照图像，对应于Exp1在0分钟、10分钟、40分钟和160分钟时的PETIS数据。

图1
全尺寸图像
22Na成像实验的示意图。(A) 食物来源（含22Na的30%蔗糖溶液）和一只蚂蚁在喂食容器中。(B) PETIS成像实验设置。(C) 电影S1左上角面板中PETIS动画在0分钟、10分钟、40分钟和160分钟时的快照图像。

为了量化每只蚂蚁持有的食物量差异，我们引入了一个分散指数。食物分散指数在方程1中定义，并使用电影S1顶部面板显示的PETIS数据计算得出。当每只蚂蚁持有的食物量差异较大时，分散指数会增加。相反，随着食物分配的进行和蚂蚁间食物量差异的减小，分散指数也会变小。在Exp1和Exp2中，食物分配逐渐进行，分散指数在大约20分钟后收敛到一个较低的共同值；然而，在Exp3中，分散指数在3小时内先增加后减少，并没有与Exp1和Exp2的值收敛（图2）。电影S1的底部面板显示了Exp1、2和3中分散指数时间变化的动画。

图2
全尺寸图像
(A) 基于像素值（22Na计数）的100只蚂蚁群体中食物分散指数的时间变化过程（电影S1），以及(B) t = 0时分散指数的标准化时间变化过程。

为了验证PETIS测量的一致性，我们将群体区域内所有像素的PETIS计数相加，以计算每个时间点的总群体放射性。实验1-3中总PETIS计数的时间过程显示在补充图S1中。在整个3小时的成像期间，总信号保持稳定。这种稳定性表明，观察到的分散指数变化（图2）反映了群体内22Na标记食物的重新分配，而不是测量漂移或总检测放射性的波动。

在PETIS成像后进行的22Na自显影和通过伽马计数器量化的每个个体的放射性显示，在Exp1和Exp2中，22Na在整个群体中分布，而在Exp3中，22Na仅在群体中的一部分个体中分布（图3）。这些结果与分散指数的结果（图2）一致。

图3
全尺寸图像
100只蚂蚁中分配的食物量。(顶部) 固定在支架上的蚂蚁；最初被喂食的蚂蚁用红色圈出。(中间) 含有22Na的蚂蚁的自显影。(底部) 量化的22Na的放射性。

我们使用图3（底部）中显示的定量伽马计数器数据估计了最初被喂食的蚂蚁最初摄入的22Na量。总22Na活性是根据每个群体中所有蚂蚁的放射性测量值计算得出的。根据这些测量结果，最初被喂食的蚂蚁重新分配的总活性估计为Exp1中24 kBq，Exp2中44 kBq，Exp3中32 kBq。这些值对应于每个群体内转移的标记食物总量，并用于评估基于伽马计数器的活性与PETIS信号强度之间的定量关系（总结在补充表S1中）。

通常认为群体内的食物分配会随时间增加。然而，在Exp3中，食物仅限于少数蚂蚁（图2A）。图2B还显示了t = 0时分散指数的标准化时间变化过程。觅食后食物分配持续了最多15分钟；然而，在15到20分钟之间，食物集中在少数个体中，之后分配和集中过程重复了几次。由于在Exp3中没有食物被丢弃的迹象，且很少有个体保留22Na（图3），食物可能是在少数个体之间反复交换的，包括最初被喂食的个体。

为了可视化和量化相对较小的蚂蚁群体中个体间的食物交换，实验设置（图1A、B）包括一只被喂食22Na标记食物（30%蔗糖溶液）的蚂蚁，该蚂蚁放置在一个包含11只蚂蚁的容器中。这个容器被放置在PETIS探测器之间，以可视化个体间22Na标记食物的交换，并获得了静态（图4）和动态（电影S2）的可视化结果。我们还使用网络摄像头（图4A；电影S2A）观察了蚂蚁的行为，然后根据PETIS成像的22Na标记蔗糖的分布推断个体间的食物交换（图4B；电影S2B）。

图4
全尺寸图像
小型蚂蚁群体中食物分配变化的定量可视化。(A) 蚂蚁的网络摄像头照片。(B) PETIS食物分配动画。(C) 每只蚂蚁的位置，用圆圈表示，圆圈的半径与它们持有的食物量成正比。(D) 个体蚂蚁（横轴）及其大小与它们持有的食物量成正比（纵轴）。面板A与面板B和C在时间上不同步；它仅用于展示蚂蚁的一般外观。

为了量化食物交换量，我们使用视频（电影S2A）提取了每秒每个蚂蚁的XY坐标，并跟踪了2000秒内的轨迹。我们跟踪了12只通过三色标记区分的蚂蚁；然而，由于一只蚂蚁的跟踪失败，只使用了11只蚂蚁的数据。每个蚂蚁的位置信息与PETIS信号值融合，计算了每个个体拥有的蔗糖量的时间变化（电影S2C、D）。我们成功观察到蚂蚁在成像开始后立即聚集，并发生了食物交换（图4D；个体2是最初被喂食的蚂蚁）。图4显示了电影S2在600秒时的快照图像。

电影S2A和图4(A)展示了一个视频及其快照，在该视频中可以同时看到多只蚂蚁。在这个视频中，视觉跟踪个体位置的时间变化具有挑战性。然而，使用本研究中开发的分析方法，我们能够为每只蚂蚁分配唯一的识别号码并随时间跟踪它们，如面板C所示。此外，通过整合面板B中呈现的22Na数据，我们能够可视化每个个体携带的食物量及其空间位置，如面板C所示。此外，如面板D所示，我们还确认可以显示每个个体食物量的时间变化。

讨论
该实验系统成功可视化和量化了大型蚂蚁群体内的食物分配变化。Buffin等人量化了进入群体的食物量增加8，而我们开发的方法提供了关于群体内食物分配随时间变化的更详细数据。我们的数据可用于描述不同环境条件和不同蚂蚁物种间食物交换的更详细变化。

本研究中的分散指数是一个有用的值，用于量化蚂蚁群体内食物分配的时间变化，但它有一定的局限性。该指数假设群体内检测到的总放射性随时间保持不变，并且整个群体始终位于PETIS视野范围内。因此，在群体保持在感兴趣区域内的稳定测量条件下，该指数最为可靠。然而，当个体频繁重叠或群体大小超过PETIS视野范围时，该指数可能会低估食物分配的差异。需要注意的是，这种基于图像的分散指数在非常小的蚂蚁群体或个体紧密聚集的情况下可靠性较低，因为在这种情况下像素级别的方差可能会大幅波动。此外，由于它基于群体的整体信号强度而不是每个个体的放射性，因此无法解释排泄、代谢衰减或密集群体内的信号衰减等生物因素。

利用荧光染料标记的食物来可视化口对口食物传播的方法2,3,4,5,6,7的一个显著优势在于它们能够实时准确追踪个体工蚁保留的食物量变化。这是通过结合标记个体跟踪和基于图像的量化实现的。然而，这种方法有两个主要限制。首先，其适用性仅限于特定的蚂蚁物种。例如，采用这种方法的研究使用了Camponotus sanctus这种蚂蚁，它们的腹部颜色较浅或仅有轻微色素沉着，这使得可以通过表皮观察到它们摄入的食物。因此，与基于放射性同位素的实验不同，这种技术并不适用于广泛的蚂蚁物种。其次，该方法缺乏检测微量食物所需的灵敏度。本研究中提出的基于放射性同位素的方法不仅能够大致实时追踪工蚁食物保留量的变化，还能够通过实验后的定量分析检测到微量的食物。我们的系统能够进行宏观和微观尺度的观察，这为构建蚂蚁群体内部大规模和小规模食物交换的模型提供了强大的研究工具。在当前的实验中，我们评估了100只蚂蚁的食物分散指数的时间变化过程。尽管典型的蚂蚁群体数量可以从几千只到数万只不等，但即使对于这样规模的群体，进行此类实验也是可行的。相比之下，由于从视频记录中提取每只蚂蚁的XY坐标存在困难，目前很难观察到个体之间的食物交换过程。预计通过应用更先进的坐标提取技术，这一限制将会得到解决。

尽管这项研究旨在技术发展，让我们从生物学角度解读所获得的结果。在实验1和实验2中，观察到了由于营养交换导致的食物扩散模式随时间的变化。而在实验3中，最初被喂食的蚂蚁在整个实验过程中大多保留了食物。这种差异可能是因为实验3在为实验1抽取100只觅食者后不久就重新采样了同一群体A。实验3中可能剩下的觅食者非常少。已知在蜜蜂工蚁中，营养交换是不均匀的，其中年龄多态性（即年轻的工蚁负责照顾幼虫，而年长的工蚁负责觅食）是一个相关因素。同样，在Anoplolepis gracilipes中也有报道指出，觅食者更有可能在营养交换中充当供体。因此，由于实验3使用的是觅食者数量不足的群体，从该小规模实验中获得的结果对于解释实验3的结果来说作用有限。

**方法**

**研究的物种和群体**
黄色疯狂蚂蚁Anoplolepis gracilipes形成了具有多个巢穴和多个蚁后的大型群体，包含数十万只工蚁。这种蚂蚁是杂食性的，在野外单独或成群捕食各种无脊椎动物，也可能啃食小型脊椎动物的尸体。它们经常聚集在分泌蜜露的半翅目昆虫周围。工蚁之间经常观察到口对口的食物交换行为。2020年3月，在冲绳主岛的三个不同地点（26.21°N,127.77°E；26.25°N,127.76°E；26.76°N,128.24°E）收集了三个A. gracilipes群体（分别命名为A、B、C）。每个群体被放置在实验室（25°C，14L:10D）中的大型塑料容器（55厘米×26毫米×19毫米）内，并提供了巢材（沙子和木屑），持续了1-5个月。实验前每周两次自由提供黄粉虫和10-20%的蜂蜜水。在成像实验前几天，这些蚂蚁群体被转移到群马县高崎先进量子科学研究所的研究设施。

**成像实验**
图1A和B展示了成像实验的示意图。实验开始时，所有三个群体A、B和C都包含多个蚁后和大量的幼虫（卵、幼虫和茧）。群体A和B各自包含大约500只工蚁，群体C包含大约1000只工蚁。实验分为两个阶段（每个阶段持续2-4天）。首先进行了实验1-3（以下简称Exp.1-3）。实验1从群体A中抽取工蚁，实验2从群体B中抽取工蚁，而实验3则使用在实验1之后从群体A中重新抽取的100只工蚁进行。大约在实验1-3三个月后，使用群体C进行了一个包含12只工蚁的小规模实验。

**工蚁采样方法**
在蚂蚁中，工蚁之间通常存在劳动分工。在Anoplolepis gracilipes中，已知负责食物交换的个体更有可能是觅食者。因此，为了选择更多的觅食者，我们用刷子仔细地从群体中捡起了100只在巢外活动的个体（巢外放置了腐烂的木头）。由于采样开始时巢外活动的个体少于100只，我们花费了一些时间直到捡到100只个体。对于包含12只工蚁的小规模实验，由于巢外有足够的个体，采样过程并不漫长。

这100只或12只蚂蚁被转移到一个涂有四氟乙烯的塑料成像容器（160毫米×105毫米×55毫米）中以防止它们逃跑，并让它们禁食过夜。在成像实验之前，向19毫升30%的蔗糖溶液中加入1微升22Na溶液（放射性约为500 kBq）制成放射性标记的食物。在喂食容器（70毫米×70毫米×100毫米）内放置一层聚膜（10毫米×10毫米×127微米），加入20微升放射性标记的食物，然后从100只或12只蚂蚁中选择一只蚂蚁，在其腹部背面涂上珐琅漆，并将其放入喂食容器中。使用数码相机确认这只蚂蚁至少吸食了2分钟的放射性标记食物，之后将其放入含有100只（图1C）或12只（图4）蚂蚁的成像容器中。成像容器随后被放置在PETIS探测器之间，使用PETIS连续测量22Na信号的分布情况3小时。同时，使用放置在PETIS探测器表面的数码相机记录每只蚂蚁的移动情况。在图2的实验中，只有最初摄入标记食物的蚂蚁的腹部被涂上了珐琅漆；而在图4的实验中，所有蚂蚁的腹部都用三种颜色标记了珐琅漆。

**数据分析**
使用PETIS获得的成像数据表示22Na标记的蔗糖随时间分布的变化，通过ImageJ（美国国立卫生研究院，贝塞斯达，MD；http://rsb.info.nih.gov/ij/）以每秒1帧的速度转换为TIFF图像。PETIS系统的空间分辨率为每像素1.1毫米。TIFF图像使用Python SciPy库（http://www.scipy.org/）进行了以下两种分析：

1. **大规模蚂蚁群体中食物分布变化的实时可视化**
对于实验1、实验2和实验3（这些实验都是对大规模蚂蚁群体中食物分布随时间变化的实时可视化研究），我们量化了整个群体中食物分布的时间常数。具体来说，在将显示22Na标记的蔗糖随时间分布的PETIS成像数据转换为每秒1帧后，使用Python SciPy库计算了每帧的方差与平均值之比（\({s}^{2}/\overline{x}\)作为分散指数，该指数通过以下公式定义以确定随时间的变化：
$$s^{2} /\overline{x} = \frac{{\mathop \sum \nolimits_{i = 1}^{N} \left( {x_{i} - \overline{x}} \right)^{2} }}{{\mathop \sum \nolimits_{i = 1}^{N} x_{i} /N}}\sim \frac{{N\mathop \sum \nolimits_{i = 1}^{N} x_{i}^{2} }}{{\mathop \sum \nolimits_{i = 1}^{N} x_{i} }}$$
其中\({s}^{2}\)、\(\overline{x}\)、\(N\)和\({x}_{i}\)分别表示方差、平均值、每帧中的像素数量以及第\(i\)个像素的PETIS计数。在这个公式中，我们假设平均值\(\overline{x}\)几乎为零。这是对蚂蚁持有的食物量差异的量化，当蚂蚁持有的食物量差异较大时，方差与平均值之比会增加；相反，当食物分配更加均匀，蚂蚁持有的食物量差异较小时，该比值会减小。由于直接绘制每帧的方差与平均值之比难以读取随时间的变化趋势，因此在图2中绘制了前500帧数据的平均值。

2. **小规模蚂蚁群体中个体间食物交换的可视化**
使用UMATracker分析了同时用PETIS拍摄的12只蚂蚁的立体视频图像。计算了每只蚂蚁的位置（用三色墨水标记）。当两只或更多蚂蚁靠近或重叠时，UMATracker的输出偶尔会出现跟踪错误。在这种情况下，通过手动检查原始视频记录来手动审查和纠正轨迹，以确保准确识别个体。从上述分析和相应实验的PETIS TIFF图像数据中获得的每只蚂蚁的位置的时间变化数据被用来确定每只蚂蚁的放射性变化。每只蚂蚁的放射性定义为以每只蚂蚁为中心、半径为5.5毫米（相当于5个PETIS像素）的圆内包含的像素总和。当一个像素被多个圆包含时，我们假设最接近该像素的蚂蚁拥有该像素的所有放射性。这种划分方法称为Voronoi划分。

为了将PETIS数据与UMATracker获得的位置数据整合起来，我们首先校正了两个坐标系统之间的空间不匹配。从网络摄像头视频中提取的原始UMATracker坐标被偏移和缩放以匹配PETIS坐标框架，并优化了这些转换参数，使两个数据集在空间上对齐。为了实现PETIS图像和UMATracker输出之间的时间同步，还需要额外的校正步骤。由于两个系统的帧率本身不同步，我们对UMATracker数据的播放速度进行了周期性调整。最初由研究人员手动确定实现时间和空间一致性的参数，随后通过最小二乘优化进行了微调，以最大化分配给每只蚂蚁的放射性示踪剂的量。

尽管校正后的UMATracker输出与PETIS图像（图4；电影S2A）吻合良好，但网络摄像头视频本身没有进行时间调整。UMATracker生成的坐标数据是基于文本的，允许直接调整播放速度，而网络摄像头记录是以视频文件形式存储的，精确的时间编辑在技术上具有挑战性。因此，原始网络摄像头录像未进行时间调整就直接呈现了出来。