《Nature Communications》：Toolbox of FRET-based c-di-GMP biosensors and its FRET-To-Sort application for genome-wide mapping of c-di-GMP regulation
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研究人员为深入探究细菌第二信使c-di-GMP复杂且动态的全局调控网络，构建了覆盖不同亲和力的FRET基c-di-GMP生物传感器工具箱，并据此建立了FRET-To-Sort方法，对浮游大肠杆菌进行全基因组筛选。研究发现鞭毛基因突变显著影响c-di-GMP水平，并揭示了鞭毛旋转抑制通过增加质子驱动力(PMF)来降低c-di-GMP生物合成的机制，深化了对细菌生活方式转换调控的认识。
在微观的细菌世界中，细胞并非只是被动生存，它们能感知环境变化并做出复杂的“决策”，例如在自由游动的浮游状态与附着形成生物膜的固着状态之间切换。指挥这种生活方式转换的“指挥官”之一，是一种名为环二鸟苷酸(c-di-GMP)的第二信使分子。它的细胞内浓度如同一个精密的调节旋钮，高水平通常促进生物膜形成等固着行为，低水平则利于游动和散播。然而，这个旋钮本身被一个极其复杂的调控网络所控制，包括合成酶、降解酶以及各种效应蛋白。更关键的是，c-di-GMP的浓度能在很宽的范围内动态变化。长期以来，科学家们面临一个核心挑战：如何在活细胞内，灵敏且定量地检测不同浓度范围的c-di-GMP动态，并进而系统性地解析是哪些基因在参与这个庞大网络的调控？传统的生化方法往往难以在单细胞水平、实时地捕捉这种动态，而全基因组规模的筛选又缺乏直接针对c-di-GMP浓度变化的高通量读数方法。
为了解决这些问题，一项发表在《Nature Communications》上的研究应运而生。研究人员的目标是开发一套强大的工具，不仅能够精确测量细胞内的c-di-GMP浓度，更能利用这种测量能力，像“大海捞针”一样，从全基因组尺度找出所有影响c-di-GMP水平的基因。他们的思路是双管齐下：首先，打造一个多功能的“探测工具箱”——一系列具有不同“灵敏度”（即结合亲和力）的基于荧光共振能量转移(FRET)的c-di-GMP生物传感器，确保无论c-di-GMP浓度高或低，都有合适的工具能检测到明显的FRET信号变化。接着，他们创造性地将这个工具箱与高通量细胞分选技术结合，发展出一种名为“FRET-To-Sort”的新方法，用于对携带条形码标记的转座子突变体文库进行全基因组筛选，直接根据c-di-GMP的FRET信号变化来富集或分选细胞，从而绘制出调控c-di-GMP的基因网络图谱。
这项研究主要依托几个关键技术方法：一是构建并表征了一个覆盖不同结合亲和力的FRET基c-di-GMP生物传感器工具箱，用以检测宽浓度范围的c-di-GMP。二是建立了FRET-To-Sort方法，该方法以大肠杆菌(Escherichia coli)浮游细胞为模型，利用流式细胞分选技术，根据生物传感器产生的FRET信号，对一个全基因组的条形码转座子插入突变体文库进行筛选，以鉴定影响c-di-GMP水平的基因。
研究结果
构建一个具有阶梯式亲和力覆盖的FRET基c-di-GMP生物传感器工具箱
研究人员成功构建并表征了大量FRET基c-di-GMP生物传感器。这些传感器能产生大幅的FRET信号变化，并且其设计使其具有阶梯式覆盖的不同结合亲和力。这意味着这个传感器集合能够灵敏地检测到细胞内各种不同浓度的c-di-GMP，为后续研究提供了灵敏且可定量的探测工具。
应用FRET-To-Sort进行全基因组筛选，揭示c-di-GMP调控网络
利用上述工具箱中不同亲和力的FRET生物传感器，研究人员建立了FRET-To-Sort方法，并应用于浮游大肠杆菌细胞，以系统研究c-di-GMP调控的全基因组网络。该方法的核心是通过基于FRET的细胞分选技术，对一个条形码转座子文库进行筛选。
鞭毛基因突变在影响c-di-GMP水平的突变中显著富集
通过FRET-To-Sort筛选，研究人员观察到，在那些影响c-di-GMP水平的突变中，两类鞭毛基因的突变出现了显著的富集。这一发现直接将细菌的运动器官——鞭毛，与c-di-GMP的全局调控网络联系了起来。
鞭毛旋转受抑制通过增加质子驱动力(PMF)降低c-di-GMP生物合成
进一步的机制研究表明，鞭毛旋转受到抑制后，会导致c-di-GMP的生物合成减少。研究人员揭示，这一现象是由于鞭毛旋转被抑制后，细胞的质子驱动力(proton motive force, PMF)增加了。增加的PMF进而导致了c-di-GMP生物合成的下降，从而建立了“鞭毛功能—细胞能量状态—第二信使水平”之间的调控链路。
结论与讨论
本研究通过构建一个多亲和力的FRET基c-di-GMP生物传感器工具箱，并创新性地发展出FRET-To-Sort这一高通量筛选方法，成功实现了在单细胞分辨率下对细菌c-di-GMP全局调控网络的系统性图谱绘制。研究不仅提供了一套强大的研究方法学工具，其应用结果更带来了重要的生物学发现：首先，在全基因组尺度上证实了鞭毛组装和功能相关基因是c-di-GMP水平的关键调控因子，揭示了运动性与群体行为（由c-di-GMP调控）之间的深层分子联系。其次，研究阐明了具体的机制，即鞭毛旋转的物理过程会影响细胞的能量状态（以PMF衡量），进而调控c-di-GMP的合成。这打破了将鞭毛单纯视为运动结构的传统认知，将其定位为感知机械力或能量状态并传导信号至全局调控网络的关键枢纽。这项工作深化了我们对细菌如何整合环境信号、能量代谢与第二信使网络以协调生活方式转换的理解，其开发的FRET-To-Sort方法也为研究其他信号分子的全基因组调控提供了可推广的新范式。
