宿主SNARE蛋白介导溶酶体与PVM融合以支持疟原虫肝脏感染

《Cells》：Host SNARE Proteins Mediate Lysosome and PVM Fusion to Support Plasmodium Liver Infection Kodzo Atchou, Nicolas Kramer, Annina Bindschedler, Jacqueline Schmuckli-Maurer, Reto Caldelari and Volker T. Heussler

　　

摘要： 特发性肺纤维化（Idiopathic pulmonary fibrosis, IPF）是一种以不可逆纤维化为特征的进行性间质性肺疾病。细胞异常分化在IPF的发生发展中起关键作用。尽管近期研究表明线粒体功能障碍可能在IPF中起作用，但其对纤维化的直接影响仍不清楚。本研究旨在通过使用线粒体功能受损的小鼠（mito-mice ND6M）模型，阐明线粒体在肺细胞分化和肺纤维化发展中的作用。该模型小鼠因线粒体DNA（mtDNA）突变（G13997A）导致呼吸链复合体I活性降低。研究人员通过对野生型和mito-mice ND6M小鼠注射博来霉素（Bleomycin, BLM）来诱导肺纤维化，并分析了从两类小鼠中生成的骨髓来源巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophages, BMDMs）和原代肺成纤维细胞，分别评估M1/M2极化（polarization）和肌成纤维细胞分化。与野生型小鼠相比，mito-mice ND6M在BLM给药后表现出更严重的纤维化和更低的存活率。BLM给药后，mito-mice ND6M肺中的乳酸产生量显著高于野生型小鼠。用TGF-β1处理的mito-mice ND6M来源的成纤维细胞表现出增加的α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）表达。虽然I型胶原表达在这两类小鼠间无差异，但TGF-β1诱导的丝氨酸-甘氨酸通路（serine–glycine pathway）中两种酶（phosphoserine phosphatase, PSPH 和 serine hydroxymethyltransferase2, SHMT2）的表达在mito-mice ND6M中显著高于野生型小鼠。另一方面，线粒体功能障碍对肺部炎症和M1/M2巨噬细胞极化的影响较小。总之，线粒体功能障碍促进了TGF-β1诱导的肌成纤维细胞分化和BLM诱导的肺纤维化。因此，线粒体依赖的代谢重编程可能代表了IPF的一个有前景的治疗靶点。

研究背景

特发性肺纤维化（IPF）是一种预后不良的肺疾病，其发病机制被认为是肺泡上皮慢性损伤导致过度修复和进行性纤维化。IPF的发生与成纤维细胞分化为肌成纤维细胞、肺泡巨噬细胞的M2极化等细胞异常分化密切相关。阐明这些致病性细胞分化的机制对于控制IPF进展至关重要。有观点指出，IPF主要发生在60岁以上老年人，提示衰老相关表型变化，包括端粒缩短、基因组不稳定性、自噬和线粒体功能障碍可能参与IPF发病。然而，这些变化是IPF的病因还是后果尚不明确。既往研究表明，细胞分化依赖于细胞代谢。IPF肺中氧化磷酸化（Oxidative Phosphorylation, OXPHOS）减少会增加乳酸产生，从而诱导成纤维细胞分化为肌成纤维细胞。线粒体通过调节细胞代谢可能影响细胞分化，但其具体作用仍不清楚。分析线粒体的作用在过去较为困难，而近年来携带突变mtDNA的小鼠（如mito-mice ND6^M）的发展使得功能分析成为可能。该模型小鼠携带ND6基因（编码呼吸链复合体I的一个亚基）的G13997A突变，导致复合体I活性降低，并伴随乳酸和活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）产生增加。研究人员推测，由线粒体功能障碍引起的代谢重编程可能通过异常的肺细胞分化加剧肺纤维化。本研究旨在通过分析mito-mice ND6^M，阐明线粒体依赖的代谢重编程在肺细胞分化和肺纤维化发展中的作用。

研究技术方法概述

研究人员以野生型和mito-mice ND6^M小鼠（均为8周龄雌性）为对象开展实验。通过连续6天经口咽滴注博来霉素（0.1 mg/kg）诱导肺纤维化模型。在BLM给药后第8天和第14天分别处死小鼠，分析肺部炎症和纤维化。通过苏木精-伊红染色、Masson三色染色、肺组织羟脯氨酸含量测定、蛋白质印迹等方法评估纤维化程度。通过支气管肺泡灌洗和细胞计数分析炎症细胞浸润。通过比色法测定肺组织乳酸水平。从小鼠中分离并培养了骨髓来源巨噬细胞和原代肺成纤维细胞，并在体外分别用细胞因子刺激诱导M1/M2极化或TGF-β1诱导的肌成纤维细胞分化，通过实时逆转录PCR和蛋白质印迹等方法分析相关基因和蛋白表达。统计分析采用单因素方差分析和Tukey检验，生存分析采用Kaplan-Meier法和log-rank检验。

研究结果

1. 线粒体功能障碍降低了BLM诱导肺纤维化模型的存活率

与野生型小鼠相比，mito-mice ND6^M在BLM给药后第10天或更晚开始死亡，其存活率显著低于野生型小鼠。结果表明，在BLM诱导的肺纤维化模型中，线粒体功能障碍显著加重了肺部病理并影响了存活。M. Kaplan–Meier survival curves for wild-type (WT) and mito-mice ND6^M(ND6^M) after administration of 0.1 mg/kg BLM. The data represent the probability of survival in each group (n = 16). * p < 0.05.">

2. 线粒体功能障碍增强了BLM诱导的肺纤维化

组织学检查显示，BLM导致mito-mice ND6^M比野生型小鼠发生更严重的纤维化伴肺泡结构变形，并形成蜂窝状囊肿。Ashcroft评分和肺羟脯氨酸含量在mito-mice ND6^M中均显著高于野生型小鼠。蛋白质印迹分析显示，BLM给药后，mito-mice ND6^M肺中纤连蛋白、I型胶原和α-SMA的蛋白表达水平显著高于野生型小鼠。结果表明线粒体功能障碍加剧了BLM诱导的肺纤维化。M... (A) Representative photomicrographs of the lungs stained with hematoxylin and eosin (magnification ×40 and ×100) and Masson’s trichrome (magnification ×100). (B) The Ashcroft score based on pathological findings and hydroxyproline content in the lungs. (C) The lactate levels in the lungs. (D) The protein expression of fibronectin, type I collagen, and α-smooth muscle actin (α-SMA) in the lungs. β-tubulin was used as a loading control. Data are representative of two independent experiments and shown as the mean ± SD (n = 8). * p < 0.05.">

3. 线粒体功能障碍增强了BLM诱导的乳酸产生

BLM给药后，mito-mice ND6^M肺中乳酸水平显著高于野生型小鼠。这表明在存在线粒体功能障碍的情况下，BLM诱导的肺乳酸产生增强。

4. 线粒体功能障碍对BLM诱导的肺部炎症影响较小

支气管肺泡灌洗分析显示，BLM显著增加了野生型和mito-mice ND6^MBAL液中的中性粒细胞数量，且mito-mice ND6^M中的数量显著更高。但总细胞数、巨噬细胞、淋巴细胞数量及BAL液蛋白水平在两组间无差异。肺组织中TNF-α、IL-6和MIP-2的mRNA表达在BLM接种后显著增加，但在两组间无差异。结果表明，线粒体功能障碍对BLM诱导的肺部炎症的发展影响有限。M without any differences in the expression of inflammatory cytokines and chemokines. (A) The numbers of total cells, macrophages, neutrophils, and lymphocytes, and protein levels in BAL fluids. (B) The mRNA expression of TNF-α, IL-1β, IL-6, and macrophage inflammatory protein-2 (MIP-2) in the lungs. Data are representative of two independent experiments and shown as the mean ± SD (n = 8). * p < 0.05.">

5. 线粒体功能障碍不影响BMDMs的M1/M2极化

在体外，用IFN-γ加LPS或IL-4分别刺激野生型和mito-mice ND6^M来源的BMDMs诱导M1/M2极化。M1刺激后的TNF-α mRNA表达，以及M2刺激后的TGF-β1和Arginase1 mRNA表达在两组间无差异。这表明线粒体功能障碍并不影响BMDMs的M1/M2极化。M. The mRNA expression of TNF-α (A), TGF-β1, and arginase1 (B) in BMDMs...">

6. 线粒体功能障碍促进TGF-β1诱导的肌成纤维细胞分化

TGF-β1显著上调了野生型和mito-mice ND6^M来源的原代肺成纤维细胞中α-SMA和I型胶原的mRNA表达。与野生型相比，mito-mice ND6^M来源的细胞中α-SMA表达显著更高，而I型胶原表达无差异。这表明线粒体功能障碍促进了TGF-β1诱导的α-SMA表达。此外，丝氨酸-甘氨酸通路中的两种酶PSPH和SHMT2的mRNA表达在TGF-β1刺激下也显著高于野生型小鼠。这些结果表明，线粒体功能障碍通过增强α-SMA表达和激活丝氨酸-甘氨酸通路，促进了TGF-β1诱导的肌成纤维细胞分化。M. The mRNA expression of α-SMA, type I collagen (COL1A1) (A), phosphoserine phosphatase (PSPH), and serine hydroxymethyltransferase2 (SHMT2) (B) in primary lung fibroblasts... Data are representative of two independent experiments and shown as the mean ± SD (n = 6). * p < 0.05.">

讨论总结

研究表明，在IPF患者细胞中存在呼吸链复合体活性降低、线粒体生物合成受损、mtDNA损伤和线粒体ROS产生增加等线粒体功能障碍特征。本研究通过使用mito-mice ND6^M模型，明确了单纯的线粒体功能障碍会加重BLM诱导的肺纤维化，并首次证明其可促进肌成纤维细胞分化。线粒体功能障碍对死亡率的影响表明其在此纤维化模型中起关键作用。

在IPF患者和肺纤维化模型中，成纤维细胞糖酵解增强、OXPHOS减少。TGF-β1通过增强糖酵解和线粒体生物合成诱导肌成纤维细胞分化，而抑制糖酵解或线粒体生物合成可减少TGF-β1诱导的α-SMA表达，表明α-SMA表达可能与细胞生物能量状态相关。在本研究中，线粒体功能障碍激活了糖酵解，表现为乳酸产生增加，并增强了TGF-β1诱导的α-SMA表达和丝氨酸-甘氨酸通路激活，但未改变I型胶原mRNA表达。这提示线粒体功能障碍可能通过激活糖酵解来促进α-SMA表达。值得注意的是，甘氨酸合成可通过转录后机制促进胶原蛋白产生。因此，甘氨酸合成活性的增加可能在胶原蛋白mRNA表达未变的情况下提高其蛋白水平，这与本研究中观察到的I型胶原蛋白水平升高而mRNA表达未变的现象一致。此外，IPF肺中糖酵解增加导致乳酸产生增加，局部pH值降低可激活TGF-β，进而诱导HIF1-α和LDH5表达，协同促进肌成纤维细胞分化。在mito-mice ND6^M中，增加的ROS也可能进一步激活TGF-β1。因此，线粒体功能障碍产生的多种代谢物可能共同激活TGF-β1，从而促进肺纤维化。

关于巨噬细胞极化，经典理论认为M2极化需要脂肪酸氧化和OXPHOS。然而，近期研究对代谢与极化的关系提出了更复杂的观点。本研究结果显示线粒体功能障碍对BMDMs的极化无影响，提示巨噬细胞极化可能不完全由线粒体依赖的代谢重编程决定。中性粒细胞在肺纤维化中的作用尚不完全清楚。本研究显示，线粒体功能障碍增加了BLM诱导的BAL液中中性粒细胞募集，但不改变相关细胞因子/趋化因子表达。中性粒细胞可能通过释放中性粒细胞胞外诱捕网或产生S100A8/A9与成纤维细胞相互作用促进纤维化。

本研究的局限性在于，其研究重点集中在肌成纤维细胞分化和巨噬细胞极化，未评估肺泡巨噬细胞、中性粒细胞和肺泡上皮细胞。纤维化相关的细胞因子和趋化因子也未在BAL液中进行测定。此外，研究未证实改善线粒体功能对肺纤维化的影响。

研究结论（翻译自论文结论部分）：

总之，本研究证明线粒体功能障碍会加剧肺纤维化并增加死亡率。线粒体功能障碍可能通过增强成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化来促进肺纤维化。对线粒体在肺纤维化中作用的进一步研究可能会增进我们对这种疾病的理解，并有助于开发新的治疗策略。