线粒体依赖性代谢重编程增强肌成纤维细胞分化并加重博来霉素诱导的肺纤维化

《Cells》：Mitochondria-Dependent Metabolic Reprogramming Enhances Myofibroblast Differentiation and Aggravates Bleomycin-Induced Pulmonary Fibrosis Kai Yazaki, Yosuke Matsuno, Yuki Yabuuchi, Sosuke Matsumura, Kenya Kuramoto, Kazufumi Yoshida, Masashi Matsuyama, Takumi Kiwamoto, Yuko Morishima and Nobuyuki Hizawa + 3 authors

　　

特发性肺纤维化（IPF）是一种以不可逆纤维化为特征的进展性间质性肺疾病。异常的细胞分化在IPF的发展中起着关键作用。尽管近期研究提示线粒体功能障碍可能参与IPF，但其对纤维化的直接影响尚不清楚。本研究旨在通过采用线粒体DNA突变（G13997A）导致呼吸链复合物I活性降低的线粒体小鼠ND6M（mito-mice ND6M），阐明线粒体在肺细胞分化和肺纤维化发展中的作用。通过经口咽吸入给予野生型和mito-mice ND6M博来霉素（BLM）诱导肺纤维化。分析源自两种小鼠的骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）和原代肺成纤维细胞，分别评估M1/M2极化和肌成纤维细胞分化。与野生型小鼠相比，mito-mice ND6M在接种BLM后表现出更严重的纤维化和更低的生存率。BLM给药后，mito-mice ND6M肺部的乳酸产生显著高于野生型小鼠。转化生长因子-β1（TGF-β1）处理的mito-mice ND6M成纤维细胞表现出增加的α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达。虽然I型胶原蛋白表达在这两种小鼠间无差异，但TGF-β1诱导的磷酸丝氨酸磷酸酶（PSPH）和丝氨酸羟甲基转移酶2（SHMT2）——两种参与丝氨酸-甘氨酸途径的酶——的表达在mito-mice ND6M中显著高于野生型小鼠。另一方面，线粒体功能障碍对肺部炎症和M1/M2巨噬细胞极化影响甚微。综上所述，线粒体功能障碍促进TGF-β1诱导的肌成纤维细胞分化和BLM诱导的肺纤维化。因此，线粒体依赖性代谢重编程可能代表IPF的一个有前景的治疗靶点。

该研究针对特发性肺纤维化（IPF）中线粒体功能障碍的具体作用机制不明这一科学问题，利用携带线粒体DNA突变G13997A的mito-mice ND6^M，深入探讨了线粒体功能异常如何调控细胞代谢重编程及细胞分化，进而加剧肺纤维化的病理进程。研究人员发现，线粒体复合物I活性降低导致的代谢失衡，主要通过增强肌成纤维细胞的分化潜能而非直接影响炎症反应，显著加重了博来霉素（BLM）诱导的肺纤维化严重程度，揭示了线粒体代谢在IPF发病机制中的核心地位。

在研究技术方法层面，研究人员主要采用了以下关键技术：首先，利用线粒体DNA突变（G13997A）的mito-mice ND6^M作为体内模型，通过经口咽吸入博来霉素建立肺纤维化模型，并设立野生型C57BL/6J小鼠作为对照。其次，运用病理学分析方法，包括苏木精-伊红（H&E）染色、Masson三色染色及Ashcroft评分系统对肺组织纤维化程度进行半定量评估，并通过羟脯氨酸含量测定量化胶原沉积。第三，提取原代肺成纤维细胞和骨髓源性巨噬细胞（BMDMs），分别在体外进行转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导的肌成纤维细胞分化实验及干扰素-γ（IFN-γ）/脂多糖（LPS）或白细胞介素-4（IL-4）诱导的巨噬细胞M1/M2极化实验。第四，采用实时逆转录聚合酶链式反应（Real-time RT-PCR）和蛋白质免疫印迹（Western Blot）技术检测纤维化相关基因和蛋白的表达水平。第五，通过乳酸比色法检测试剂盒测定肺组织匀浆中的乳酸浓度，以反映代谢重编程状态。

研究结果显示，在线粒体功能障碍降低BLM诱导肺纤维化模型存活率方面，生存曲线分析表明，相较于野生型小鼠，mito-mice ND6^M在BLM处理后第10天及以后开始出现死亡，且生存率显著降低，证明线粒体功能障碍加剧了肺病理损伤并影响预后。在线粒体功能障碍增强BLM诱导的肺纤维化方面，组织学检查和Ashcroft评分显示，mito-mice ND6^M肺部出现更严重的纤维化、肺泡结构扭曲及蜂窝样囊肿，且肺羟脯氨酸含量及纤连蛋白、I型胶原蛋白和α-SMA的蛋白表达水平均显著高于对照组。在线粒体功能障碍增强BLM诱导的乳酸产生方面，乳酸测定结果显示，尽管BLM在两种小鼠中均增加了乳酸水平，但mito-mice ND6^M的肺乳酸积累更为显著，证实了线粒体缺陷促进了糖酵解通量。在线粒体功能障碍对BLM诱导的肺部炎症影响较小方面，支气管肺泡灌洗（BAL）分析和肺组织细胞因子mRNA表达检测表明，虽然中性粒细胞数量有所增加，但总细胞数、淋巴细胞数、蛋白渗出及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等炎症因子的表达在两组间无显著差异。在线粒体功能障碍不影响BMDMs的M1/M2极化方面，体外极化实验显示，经刺激后，两种小鼠来源的巨噬细胞中M1标志物（TNF-α）和M2标志物（TGF-β1、精氨酸酶1）的mRNA表达无统计学差异。在线粒体功能障碍促进TGF-β1诱导的肌成纤维细胞分化方面，原代成纤维细胞实验表明，TGF-β1处理显著上调了mito-mice ND6^M成纤维细胞中α-SMA的mRNA表达，同时增强了丝氨酸-甘氨酸途径关键酶（PSPH和SHMT2）的基因表达，而I型胶原蛋白（COL1A1）的mRNA水平未见改变。

讨论部分指出，该研究首次利用mito-mice ND6^M模型阐明了单纯的线粒体功能障碍本身即可促进BLM诱导的肺纤维化。研究发现，线粒体功能障碍通过激活糖酵解（表现为乳酸增加）和丝氨酸-甘氨酸途径，特异性地增强了TGF-β1诱导的α-SMA表达，从而促进肌成纤维细胞分化，而这一过程并非通过调节M1/M2巨噬细胞极化实现。此外，研究还讨论了ND6亚基在线粒体复合物I结构和功能稳定性中的关键作用，以及乳酸微环境酸化可能通过激活TGF-β信号通路间接推动纤维化进程的潜在机制。研究结论强调，线粒体功能障碍加剧了肺纤维化并增加了死亡率，其机制在于促进了成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化，因此靶向线粒体依赖性代谢重编程可能为IPF的治疗提供新的策略。