全切片成像中的颜色标准化：一种减少颜色差异的方法

《Journal of Histotechnology》：Color standardization in whole slide imaging: a method to reduce color variability

　　**摘要**
在数字病理学中，颜色标准化对于确保全切片成像（WSI）扫描仪之间的一致性至关重要。本研究利用来自多个WSI扫描仪的颜色数据，这些数据来自包含55个具有组织学染色光谱特性的颜色斑块的切片，并结合专有算法生成国际色彩联盟（ICC）配置文件。通过将扫描仪生成的颜色值转换为与其真实光谱值对齐的形式，该方法实现了有效的颜色标准化。在标准化前后，比较了各种扫描仪型号的色域与真实光谱值，以及显示技术中常用的标准红、绿、蓝（sRGB）色域。结果表明，WSI扫描仪应用了显著不同的线性曲线和色调曲线配置文件，并且在白点和黑点校准方面也存在差异。所提出的基于ICC的标准化方法大大减少了扫描颜色值与其真实光谱值之间的差异。这种方法展示了在数字病理工作流程中减轻扫描仪引起的颜色变异性的潜力。随着人工智能越来越多地融入病理学领域，解决人类观察者与机器学习算法之间的颜色呈现差异问题变得至关重要。应用标准化校准将确保用于准确诊断方法的数据一致性，从而可靠地扩展数字病理学的应用。本文提供的独特大规模数据集揭示了不同图像源可能产生显著不同输出的情况。行业最佳实践是使用相同的标准方法和可量化的准确性对所有扫描仪进行校准，以实现真正的标准化，而不是本文所展示的各种方法。

**关键词**
颜色保真度；染色；标准化；质量保证；数字病理学；全切片成像（WSI）；ICC配置文件；扫描仪差异性

**引言**
数字显微镜和全切片成像（WSI）的采用为病理学领域带来了重大进步，提高了诊断效率、可访问性和数据整合能力。然而，这一转变也突显了强大的颜色管理对于确保诊断准确性的关键需求——无论是对于解读数字切片的病理学家，还是对于人工智能（AI）算法的开发和验证。在数字病理工作流程中，颜色变异可能来自多个来源，包括不同扫描仪制造商之间的差异、同一扫描仪型号内的变化以及扫描仪性能的时间漂移。认识到这些挑战，美国食品药品监督管理局（FDA）发布了关于WSI系统中颜色管理的指南。具体而言，FDA建议系统应包含比较和对齐真实颜色（光谱参考）、预期颜色（设计颜色）和输出颜色（渲染颜色）的机制。FDA进一步指出，WSI系统应使用包含一组可测量且具有代表性的颜色斑块的测试切片进行测试，这些颜色斑块应具有与染色组织相似的光谱特性，从而支持整个诊断流程中相关、一致和可靠的颜色再现。基于胶片的颜色管理方法有着悠久的历史，通常涉及使用待评估的设备对标准化颜色目标进行成像。然后使用所得图像生成特定于设备的国际色彩联盟（ICC）配置文件，通过补偿成像系统的独特特性来实现更准确的颜色再现。这些方法本质上受到所用胶片染料的光谱特性的限制——通常是青色、品红色和黄色的组合，它们的光谱特性与组织病理学染料明显不同，当应用于病理成像时可能导致显著的颜色再现误差，这种现象称为“异色性”。Sierra颜色校准切片（PathQA，英国）的开发既解决了易于在WSI扫描仪中使用的物理校准设备的需求，也解决了病理学中存在代表性颜色的问题。该切片包含专有的生物聚合物薄膜斑块，这些薄膜可以吸收各种常规和特殊的组织化学染色剂，从而在光谱上模拟真实组织，以避免异色性的影响——即一个WSI扫描仪测量的两种颜色在该扫描仪下看起来相同，但在真实光谱特性上存在显著差异，而在不同的照明条件下，另一种WSI扫描仪或人眼可能会以不同的方式呈现这些颜色。这种方法支持为数字病理工作流程的所有方面建立国际标准的更广泛目标，从玻璃切片的真实光谱到最终显示。

**材料与方法**
所使用的Sierra颜色校准切片包含55个染色的生物聚合物颜色斑块，排列成5×11的矩形网格图案。这些切片在10个供应商提供的14种不同且市面上可购买的扫描仪上进行了扫描，据作者所知，这是唯一使用这种特定方法的最大跨供应商数据集。为了比较，图像和扫描仪被匿名标记为A-O；扫描仪D和E均来自供应商1，扫描仪G、H、I和O均来自供应商2，而A和J均来自供应商3。此外，扫描仪H和I是同一型号但在不同扫描放大设置下的扫描仪。其余扫描仪（B、C、F、K和L）来自不同的制造商，因此是不同的型号。使用这些切片的扫描结果生成了ICC配置文件，其过程如图1所示，并在下面进行描述。图1. 颜色管理工作流程：Sierra颜色校准切片在WSI设备上扫描，提取的RGB值与真实光谱颜色进行比较，得到“ΔE before”。提取的RGB值和真实光谱颜色用于创建Sierra ICC配置文件，得到Sierra颜色，“ΔE after”表示Sierra颜色与真实颜色的比较结果。

**简要说明**
从扫描的切片图像中提取了每个颜色斑块的红色、绿色和蓝色（RGB）值。由于数字工作流程中颜色管理策略的一致性不足，并且并非所有图像都包含嵌入的ICC配置文件，因此在此阶段没有应用任何嵌入的ICC配置文件，以公平地显示图像采集的差异。将每个斑块的提取RGB值与使用可追溯到英国国家物理实验室（NPL）的校准分光光度计测量的真实光谱值进行比较。应用了一种专有算法（PathQA，英国），将测量的扫描仪RGB值转换为它们的真实光谱颜色，这种转换符合ICC配置文件的规范（ISO 15076–1）。为每个扫描仪生成了单独的ICC配置文件，将每个扫描仪RGB斑块的值转换为校正后的光谱颜色，并且对于这项研究，每个ICC配置文件还包含一个反向转换，将校正后的光谱颜色转换回原始扫描仪RGB值。这种技术通常用于在将转换应用回原始颜色空间后“往返”评估配置文件的准确性。

每个切片中的中性色斑块提供了一个灰度渐变（从透明到不透明均匀分布），以便根据FDA指南测量WSI的灰度响应。将扫描仪中性色斑块的RGB值与已知光谱测量值对应的预期透射率进行绘制，可以显示每个扫描仪的色调曲线。色调曲线是一种图像编辑工具，用于调整数字图像（包括WSI）的对比度，以强调阴影和高光等特定区域的呈现方式。绘制每个扫描仪的色调曲线显示了不同制造商在图像呈现方法上的差异。CIELAB颜色空间由ISO/CIE 11,664–4:2019(EN)规定，是一种表示人类颜色感知全范围的颜色空间。CIELAB颜色空间有助于确定在数字成像过程中感知到的颜色是否能够准确显示。用于量化颜色差异的目标指标来自CIELAB颜色空间，称为CIEΔE2000（ΔE），由ISO/CIE 11,664–6:2022(EN)规定。ΔE是典型人眼观察到的视觉颜色差异的度量单位，其中2 ΔE是两种颜色之间可分辨的最小差异。在此应用中，ΔE可以用作使用Sierra颜色校准切片进行ICC配置前后颜色差异的定量度量。

如上所述，每个ICC配置文件中包含的反向转换使得单个扫描仪上的颜色校正WSI扫描结果可以表示为来自任何具有相应ICC配置文件的扫描仪型号或制造商的结果。对图像进行反向转换后，可以直观比较每个单独扫描仪的颜色对同一WSI文件的影响。在一个组织切片上使用扫描仪F进行扫描，并计算相关的ICC配置文件，将组织图像的颜色转换为真实光谱颜色，这是参考颜色校正后的组织图像。然后将每个ICC配置文件中的反向转换应用于参考颜色校正后的图像，以获得每个15个扫描仪数据集中组织图像在原始颜色空间中的预期颜色。

**结果**
使用从九个中性色斑块中提取的RGB值（包括黑色斑块和白色斑块，如图2所示），可以发现不同扫描仪之间的色调曲线形状和白色斑块的强度（最大RGB值）存在差异。即使扫描仪来自同一供应商，也观察到了差异，例如G与H或A与J之间的差异。此外，同一扫描仪在不同扫描放大设置下也会产生中性色输出的不同，例如H与I之间的差异。图2. 本研究中使用的15个扫描仪数据集（A-O）的色调曲线差异。D和E均来自供应商1，G、H、I和O均来自供应商2，而A和J均来自供应商3。H和I是同一型号但在不同扫描放大设置下的扫描仪。彩色*表示变化的RGB值，实线代表线性中性刻度，以便于数据比较。

图3显示了Sierra颜色校准切片在CIELAB颜色空间中的真实光谱颜色分布。通过叠加标准RGB（sRGB）显示器色域，可以看出Sierra颜色校准切片中包含的一些组织学染料的颜色超出了sRGB色域，这些颜色在常规组织病理学和细胞学中也能找到。因此，即使扫描仪能够忠实成像这些染料，某些染色组织也可能无法被sRGB显示器或IMS色域准确表示。图3. CIELAB颜色空间与sRGB显示器色域（阴影区域）的3D散点图，显示了分析中使用的Sierra颜色校准切片的真实光谱颜色。

为了可视化这种颜色差异的影响，使用反向配置文件来表示不同扫描仪显示的相同扫描图像，如图4所示。图4. 使用反向配置文件展示了使用扫描仪F扫描的三个组织切片的相同参考图像时，15个不同扫描仪数据集的颜色输出差异。面板中使用的染色剂分别是苏木精和伊红（i）、3,3-二氨基联苯胺（DAB）（ii）和Masson三色染色（iii）。

使用Sierra颜色校准切片生成的ICC配置文件显示，与真实光谱值相比，所有15个扫描仪数据集的扫描颜色再现更为准确。图5显示了每个扫描仪的ΔE值比较。简而言之，配置文件应用前的所有扫描仪之间的平均（M）和标准差（SD）扫描颜色差异为17.4ΔE（SD = 2.0ΔE），配置文件应用后降低到3.2ΔE（SD = 0.6ΔE），而最大颜色差异从最大值50.1ΔE（M = 17.4，SD = 2.0ΔE）降低到11.9ΔE（M = 3.2，SD = 0.6）。值得注意的是，在某些扫描仪中存在一些异常值，但在其他扫描仪上可以进行准确的ICC配置文件校正。例如，仅考虑来自同一供应商的扫描仪数据集D和E，并忽略补丁18（在图3中，该补丁的颜色位于sRGB显示范围之外），可以将最大颜色差异从11.9ΔE（M = 3.9，SD = 3.0）降低到5.1ΔE（M = 2.8，SD = 1.0）。图5显示了55个Sierra颜色校准片每个补丁的ΔE值，“校准前”（上图）和“校准后”（下图）的对比，这些数据集用于本研究的15个扫描仪。

讨论：
不同的WSI（Whole Slide Imaging）扫描仪采用不同的颜色处理方法，有些应用色调曲线，而有些则产生更线性的输出。这可能导致根据扫描仪制造商的不同偏好，显示的切片图像的具体色调特征存在不一致性。这些差异突显了使用不同扫描仪进行观察的病理学家所面临的问题严重性。值得注意的是，不仅不同制造商和扫描仪型号之间存在差异，同一制造商的不同型号之间也存在差异，有些扫描仪数据集无法充分显示某些补丁的颜色，从而无法通过ICC（International Color Consortium）配置文件进行准确校正。此外，同一扫描仪在不同工作状态下也会表现出色调梯度的差异，表明即使一致使用同一型号的扫描仪，也不能保证颜色的可重复性。这些发现表明，仅依赖制造商的一致性来保证数字病理学中的颜色再现是有限的，因为本研究中评估的扫描仪制造商和型号的多样性非常具有代表性。

对使用Sierra颜色校准片捕获的图像进行进一步分析表明，该校准片能够检测和校正特定于扫描仪的颜色变化。值得注意的是，这些颜色范围超出了显示技术中常用的sRGB颜色范围，尽管每个补丁在临床环境中的真实组织切片中都有对应的光谱特征。这一观察结果与先前的研究结果一致，即组织染色通常会超出sRGB范围 [Citation10]。因此，任何限制在sRGB空间内的颜色分析都可能导致数字观察者获得的信息与实际显微镜观察结果之间存在差异。这些差异对诊断验证具有重要意义，特别是在将人类解读与人工智能驱动的分析进行比较时 [Citation11]。需要进一步研究以评估这些颜色限制对诊断准确性以及使用全数字人类评估者的算法和验证的影响。

在显示时应用ICC配置文件可以保留像素数据，确保原始图像保持不变 [Citation12]。当这一原则应用于组织病理学时，未来可以使用新兴技术重新分析而无需重新扫描组织，从而支持数字病理工作流程中的长期数据完整性和分析灵活性。

最后，使用基于真实光谱的颜色校准片生成ICC配置文件可以有效减少扫描图像中的颜色差异。然而，要充分利用颜色管理，应使用经过校准的显示器——理想情况下，这种显示器应已获得监管机构（例如FDA）的批准 [Citation13]——并且图像管理系统必须应用ICC配置文件。如果没有这些组件，数字病理工作流程中可能无法完全实现准确的颜色保真度。建议在使用由数字产品创建的产品或图像之前，确认提供者在ICC配置文件的使用、理解和识别方面的技术能力。

数字病理学的一个目标是通过明场显微镜复制人类眼睛观察组织样本的视图。本研究展示了扫描仪在扫描后修改之前的真实光谱性能。如前所述，完整的像素路径取决于颜色管理是否正确实施，以及连接组件是否连续识别出颜色数据可能来自多个来源：图像中嵌入的通用ICC配置文件、扫描仪查看器中关联的通用ICC配置文件、成像后的外部ICC配置文件应用，或者没有ICC配置文件的颜色管理。目前尚无标准化的颜色管理策略，因此需要一种全球统一且独立于供应商的数字病理学颜色管理和质量保证方法。

本研究的局限性在于没有考虑时间变化和扫描仪漂移，这可能是导致变异性的一个重要因素，需要进一步研究。本研究中的大量扫描仪已经显示出显著的差异，预计随着扫描仪漂移的不同方向，这种差异会进一步加剧。此外，图5中的异常值表明，不同扫描仪在检测同一测试对象的颜色时存在不同的能力。只有当扫描仪从目标切片中测量到足够的数据时，ICC配置文件的数学模型才能准确转换颜色。像扫描仪D和E这样的具有共同供应商的异常值强烈表明，这些成像系统在像素路径的开始阶段无法准确捕捉所有组织颜色。这提出了一个需要更彻底研究的进一步质量保证问题，其影响也需要认真考虑，但这超出了本研究的范围。下一步将是与监管机构和外部质量评估（EQA）提供商合作，定义基于标准的方法来监控和限制所有不受控制的变异源，作为常规质量保证的一部分。

为了对数字病理学部署的一致性做出明智的决策，制定颜色质量保证测量的频率指南非常重要。定期监测扫描仪数据的稳定性对于确认组织内的诊断可靠性或在类似严格条件下跨组织共享数据至关重要；这种监测将使WSI与其他病理工作流程方面保持一致，例如国家质量保证咨询小组（NQAAPs）或医疗保险和医疗补助服务中心（CMS）评估临床实验室的组织学和诊断性能，通常通过EQA提供商进行，或者同时进行这两种评估。虽然这将有助于监测问题，但最佳实践是对WSI扫描仪的输出进行颜色校准，以消除由WSI扫描仪引起的变异。这样做还有助于避免破坏组织学实验室在数字化之前获得的认证成果。

由于数字病理学和人工智能行业仍处于相对初级阶段，现在有机会在完全数字化之前实施流程来解决这些问题；随着更多扫描仪进入市场，这种问题将进一步加剧。实施基于标准的颜色校准将使人工智能更具前瞻性，因为标准化是一种预防措施，可以消除整个行业的变异性。否则，大量的时间和资源将用于大数据和黑盒标准化，通常结合昂贵的基础模型，试图解决成像层面引起的变异问题。