《International Journal of Molecular Sciences》：Reduced GEN1 Expression Is Associated with Elevated DNA Damage and Impaired Proliferation in Endometriosis-Derived Endometrial Organoids
Berivan Guzelbag,
Nazli Ece Gungor,
Hadice Karahan,
Alireza Maghsoudi and
Engin Oral
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子宫内膜异位症（EMs）作为一种复杂的妇科疾病，其发病机制特别是基因组不稳定性与DNA修复缺陷的关系仍不明确。本研究聚焦于同源重组（HR）关键酶GEN1，利用患者来源的子宫内膜上皮类器官（EEOs）模型，首次揭示了在EMs患者子宫内膜中GEN1表达显著下调，且与基线DNA双链断裂增加（γH2AX↑）、细胞增殖受损相关，提示同源重组通路调控异常可能是EMs的潜在致病机制之一，为理解该疾病提供了新视角。
子宫内膜异位症是一种让全球近十分之一育龄女性饱受困扰的慢性疾病，其特征是类似于子宫内膜的组织“跑”到了子宫腔以外的地方生长，引发慢性盆腔痛、痛经甚至不孕等问题。尽管其发病率不低，但其背后的发病机制至今仍是一个复杂的谜题。长期以来，科学家们观察到，与健康人群相比，子宫内膜异位症患者的细胞存在一定程度的基因组不稳定性，这暗示了细胞内负责维护遗传信息“保真度”的DNA修复系统可能出了故障。然而，究竟是哪个具体的“修理工”掉了链子，这种故障又是如何一步步导致疾病发生的，相关的研究仍然匮乏。
在众多的DNA修复“工具箱”中，同源重组（Homologous Recombination, HR）通路是修复DNA双链断裂（DNA double-strand breaks）这类严重损伤的核心“精密仪器”。GEN1（Gap Endonuclease 1）是这条通路中一个关键的“分子剪刀”——Holliday连接体解离酶，负责在DNA损伤修复的后期精准地“剪开”并解开复杂的DNA交叉结构。有趣的是，近年有全外显子组测序研究发现，GEN1基因的变异可能与一个土耳其家庭的子宫内膜异位症发病相关。这就像在犯罪现场发现了一个嫌疑人的指纹，但这个“嫌疑人”（GEN1功能缺陷）在子宫内膜异位症这个“案件”中究竟扮演了什么角色，是“主犯”还是“从犯”，其作案手法又是怎样的，都亟待验证。为了破解这个谜题，研究人员将目光投向了近年来在生物医学研究中大放异彩的“类器官”（Organoid）技术。这种三维培养体系能高度模拟人体组织的复杂结构和功能，为直接在来源于患者的活细胞中进行功能研究提供了前所未有的平台。
于是，一篇发表在《International Journal of Molecular Sciences》上的研究，便利用子宫内膜上皮类器官（Endometrial Epithelial Organoids, EEOs）这一强大工具，首次系统性地探索了GEN1在子宫内膜异位症中的表达和功能。研究发现，在子宫内膜异位症患者的子宫内膜中，无论是基因（mRNA）还是蛋白水平，GEN1的表达都显著降低，几乎只有健康对照者的一半水平。更关键的是，源自患者的类器官本身也展现出增殖能力减弱、尺寸偏小的趋势，并且其细胞内的DNA损伤标志物γH2AX（phosphorylated histone H2AX，磷酸化的组蛋白H2AX，DNA双链断裂的标志）水平基线就显著高于对照组。当研究人员在类器官中利用RNA干扰（RNAi）技术“敲低”GEN1基因后，无论是健康还是患者的类器官，其细胞增殖都受到了抑制，而来自患者的类器官对这种抑制表现得更为敏感，增殖下降程度更甚。同时，GEN1的减少直接导致了细胞内DNA损伤的进一步加剧。这些发现如同一块块拼图，共同指向了一个结论：GEN1的表达下调，可能导致同源重组修复能力受损，使得细胞在面对氧化应激等压力时，DNA损伤无法被有效修复，从而积累了更多的基因“错误”，并可能通过影响细胞增殖等过程，最终参与了子宫内膜异位症的发病进程。这项研究不仅首次在类器官模型上为GEN1在子宫内膜异位症中的功能提供了直接证据，也为理解该疾病的分子机制开辟了新的视角，即DNA修复系统的缺陷，特别是同源重组通路的失调，可能是导致子宫内膜异位症发生发展的重要因素之一。
为了开展这项研究，作者们主要应用了以下几项关键技术：首先，他们从经腹腔镜确诊的子宫内膜异位症患者（n=3，III-IV期）和对照组（n=3）的子宫内膜活检样本中，成功建立了三维的子宫内膜上皮类器官（EEOs）培养体系。其次，他们运用免疫荧光、RT-qPCR（实时定量聚合酶链反应）和Western blot（蛋白质印迹）等技术，在组织和类器官水平系统比较了GEN1的表达差异。再者，通过RNA干扰（RNAi）技术在类器官中进行GEN1基因敲低，并利用BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）掺入实验评估细胞增殖变化，以及通过检测γH2AX水平来量化DNA双链断裂损伤。这些方法的结合，使得在接近生理状态的模型中探究基因功能成为可能。
2. 结果
2.1. 研究人群
研究共纳入6名女性，包括3名经腹腔镜和组织病理学确诊的子宫内膜异位症患者和3名无子宫内膜异位症证据的对照组。所有参与者在年龄、身体质量指数、月经周期天数或产次方面均无统计学显著差异。所有子宫内膜样本均在月经周期的增殖期采集。
2.2. GEN1在人类子宫内膜上皮和间质细胞中表达
通过免疫荧光分析证实，GEN1蛋白在对照组（n=3）的原代子宫内膜上皮细胞和间质细胞中均有表达，并主要定位于细胞核内。RT-qPCR分析显示，GEN1 mRNA在上皮细胞中的表达水平约为间质细胞的1.8倍。
2.3. GEN1在子宫内膜异位症患者中表达降低
与对照组相比，子宫内膜异位症患者原代子宫内膜细胞中的GEN1 mRNA和蛋白表达均显著降低（mRNA: 0.52 ± 0.14 vs. 1.00 ± 0.19；蛋白免疫荧光强度: 0.54 ± 0.18 vs. 1.00 ± 0.22），降幅约50%。
2.4. 子宫内膜类器官的建立与表征
成功从对照组和子宫内膜异位症患者的子宫内膜样本中建立了EEOs。与对照组相比，子宫内膜异位症来源的EEOs在形成效率（18.4 ± 5.6% vs. 25.2 ± 6.8%）、平均直径（124.6 ± 34.2 μm vs. 155.8 ± 32.6 μm）以及呈现囊性形态的比例上均呈现降低趋势（p值均为0.10）。免疫荧光分析进一步证实，子宫内膜异位症来源的EEOs中GEN1蛋白强度也显著低于对照组。两类EEOs均保持了雌激素受体和孕激素受体的表达。
2.5. RNAi介导的GEN1在类器官中的高效敲低
利用RNAi技术在两组EEOs中成功敲低了GEN1的表达，在mRNA和蛋白水平均实现了高效的基因沉默，且转染效率在两组间无显著差异。
2.6. GEN1敲低降低增殖并增加DNA损伤
GEN1敲低后，两组EEOs的细胞增殖均受到抑制，其中子宫内膜异位症来源的EEOs增殖下降更为显著（BrdU阳性细胞减少49.7% vs. 对照组的39.5%）。同时，GEN1敲低直接导致了两组EEOs中DNA损伤标志物γH2AX免疫荧光强度的增加。重要的是，子宫内膜异位症来源的EEOs本身就表现出比对照组显著升高的基线γH2AX水平（2.32 ± 0.44 vs. 1.00 ± 0.28），表明其在未受干预时已存在更多的DNA双链断裂损伤。
3. 讨论与结论
本研究首次在患者来源的子宫内膜类器官模型中探究了DNA修复酶GEN1的功能及其在子宫内膜异位症发病中的潜在作用。核心发现是：GEN1在子宫内膜异位症患者的在位内膜中表达显著下调；源自患者的EEOs维持了低GEN1表达状态，并在GEN1被进一步敲低时表现出更剧烈的增殖抑制和DNA损伤加剧反应；且这些EEOs本身就存在更高的基线DNA损伤。
这些结果从功能层面支持了DNA修复缺陷，特别是同源重组通路失调，在子宫内膜异位症发病机制中扮演重要角色的假说。子宫内膜异位症细胞可能因氧化应激等微环境因素承受更高的DNA损伤压力，而本已低表达的GEN1使得同源重组修复能力“捉襟见肘”，导致基因组不稳定性加剧。这种“合成致死”效应（即已有缺陷的细胞对同一通路的进一步抑制更敏感）在患者EEOs对GEN1敲低更剧烈的反应中得到体现。类器官模型的优势在于能更好地保留患者组织的原始特性，使得这些发现更具生理和病理相关性。
研究的创新性在于首次利用类器官模型将GEN1的表达下调与子宫内膜异位症的细胞表型（增殖受损、DNA损伤增加）在功能上直接联系起来，为理解该疾病的分子基础提供了新的实验证据。尽管存在样本量较小、仅纳入晚期患者等局限性，但这些发现提示，针对DNA修复通路（如同源重组）的深入研究，不仅可能为子宫内膜异位症的诊断生物标志物开发提供新思路，也可能在未来启发新的治疗策略探索。总之，这项工作深化了我们对子宫内膜异位症中基因组不稳定性机制的认识，并展示了类器官模型在解析复杂疾病机理方面的强大应用价值。
