CRISPR/Cas基因编辑技术在乳酸菌中的应用与研究前景

《Microorganisms》：Application and Research Prospects of CRISPR/Cas Gene Editing Technology in Lactic Acid Bacteria Erhong Zhang, Jiao Yan, Jiahao Du, Xiao Chu and Dahua Chen

　　

摘要：多年生牧草混播已成为生产大量饲草、支持可持续畜牧业发展的一种高效方式。饲草生产的稳定性和可持续性在很大程度上受土壤健康控制。然而，多年生混播系统土壤健康的变异在不同条件下仍需进一步研究。阐明土壤理化性质与微生物群落之间的关系对于更好地理解多年生栽培草地土壤健康至关重要。研究人员通过比较建立七年后苜蓿-禾草混播及其相应单播的土壤养分、酶活性、微生物群落和饲草产量，评估了苜蓿分别与猫尾草或光滑雀麦草混播组合对土壤健康的影响。与苜蓿和猫尾草单播相比，苜蓿-猫尾草混播的饲草干物质产量分别显著增加了61.39%和1188.29%；与苜蓿和光滑雀麦草单播相比，苜蓿-光滑雀麦草混播的饲草干物质产量分别显著增加了54.36%和736.38%。混播提高了土壤有机碳（SOC）、全氮（STN）、硝态氮（SNN）和铵态氮（SAN）含量以及脲酶活性，但降低了微生物α多样性。有益类群，如芽孢杆菌属（Bacillus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）和被孢霉属（Mortierella）得以富集。土壤硝态氮（SNN）被确定为影响细菌功能组成的关键驱动因素，而土壤有机碳（SOC）、铵态氮（SAN）、水分（SWC）、碱性磷酸酶（APase）和蔗糖酶对真菌功能组成表现出显著影响。本研究表明，苜蓿-禾草混播通过改善土壤理化性质和重塑土壤微生物群落来增强系统生产力。这从土壤健康的角度为建立和管理可持续的栽培草地提供了理论依据。

论文解读

研究背景与目的

中国拥有世界第二大草原面积，长期以来在维持当地畜牧业和生态服务方面发挥着至关重要的作用。然而，由于过度放牧和气候变化，天然草地的生产力仍然很低，制约了现代畜牧业的发展。在此背景下，建立栽培草地已成为支持可持续畜牧业发展的一种有效策略。栽培草地可以生产大量优质饲草，但此生产易受多种因素（如土壤健康）的影响。土壤健康是饲草生产的关键决定因素，直接影响草地生态系统的生产力、稳定性和可持续性，其主要特征体现在土壤微生物群落和理化性质两大关键指标。豆科-禾本科组合是栽培草地实际应用中最经典、最广泛采用的配置。其中，苜蓿是广泛种植的豆科植物。然而，不同混播组合对土壤健康和微生物群落的影响尚需深入研究，尤其是在多年生混播草地生长中后期。因此，本研究旨在阐明：（1）物种组合如何影响多年生豆禾混播系统的土壤微生物区系和理化性质；（2）这两种土壤健康指标在苜蓿-禾草混播系统中的耦合关系。研究人员假设，不同的豆禾组合会导致不同的土壤理化性质和微生物群落特征，且两者在多年生豆禾混播中密切相关。

本研究在兰州大学庆阳国家草地农业生态系统野外科学观测研究站建立了长达八年的试验小区，以七年生苜蓿分别与猫尾草、光滑雀麦草的混播系统为研究对象，探究物种组合对土壤理化性质和微生物群落的影响，以期为可持续草地农业管理提供依据。论文发表在《Microorganisms》期刊。

关键技术方法

研究人员采用了单因素随机区组设计，设置了苜蓿-光滑雀麦草混播、苜蓿-猫尾草混播以及三种作物的单播共五种处理。在试验第八年苜蓿初花期，采集植物和土壤样品。测定饲草干物质产量。土壤样品一部分用于测定土壤理化性质（如pH、水分、有机碳、全氮、硝态氮、铵态氮、全磷、速效磷含量）和酶活性（脲酶、碱性磷酸酶、蔗糖酶）。另一部分用于微生物群落分析：提取土壤总基因组DNA，使用PacBio单分子实时测序技术分别对细菌16S rRNA基因和真菌ITS区进行全长扩增子测序。利用生物信息学方法分析微生物群落的α多样性、β多样性、分类组成，并利用PICRUSt2和FUNGuild工具预测微生物功能。数据统计分析在R语言环境中完成，采用方差分析、主坐标分析、置换多因素方差分析、Mantel检验等方法。

研究结果

3.1. 饲草干物质产量

播种模式显著影响饲草干物质产量。两种混播系统（苜蓿-猫尾草混播、苜蓿-光滑雀麦草混播）的产量均显著高于所有单播。具体而言，与苜蓿单播和猫尾草单播相比，苜蓿-猫尾草混播分别使产量提高了61.39%和1188.29%；与苜蓿单播和光滑雀麦草单播相比，苜蓿-光滑雀麦草混播分别使产量提高了54.36%和736.38%。两种混播之间产量无显著差异。

3.2. 土壤理化性质

与对应的禾草单播相比，豆禾混播显著改善了土壤理化性质。苜蓿-光滑雀麦草混播显著提高了土壤有机碳、全氮、硝态氮、铵态氮、水分含量和脲酶活性，但降低了土壤pH。苜蓿-猫尾草混播也显著提高了土壤有机碳、全氮、硝态氮、铵态氮和水分含量。大部分土壤理化性质在混播中达到最高水平。随机森林分析表明，土壤有机碳、硝态氮和铵态氮是预测干物质产量的重要指标，其中土壤有机碳的影响极显著。土壤磷养分含量和碱性磷酸酶活性在不同播种模式间无显著差异。

3.3. 细菌和真菌群落多样性

3.3.1. Alpha多样性

播种模式显著影响土壤细菌和真菌群落的α多样性。对于细菌群落，禾草单播的Chao1指数显著高于其他模式。对于真菌群落，禾草单播的Shannon指数显著高于其他模式。总体而言，单播禾草种植增加了稀有细菌的丰富度，同时也增强了真菌群落的均匀度。

3.3.2. Beta多样性

基于Bray-Curtis距离的主坐标分析和置换多因素方差分析表明，播种模式显著影响了细菌和真菌群落的组成结构。两种混播和苜蓿单播与两种禾草单播在主坐标轴1上明显分离，表明混播导致了土壤微生物群落的重建。

3.4. 细菌和真菌群落组成

3.4.1. 门水平组成

所有处理中，优势细菌门为变形菌门、放线菌门、酸杆菌门等。与禾草单播相比，两种混播和苜蓿单播增加了厚壁菌门的相对丰度，降低了放线菌门的相对丰度。优势真菌门为子囊菌门、担子菌门和被孢霉门。混播系统显著富集了被孢霉门。

3.4.2. 属水平组成

优势细菌属包括芽孢杆菌属、未分类细菌、类芽孢杆菌属等。与禾草单播相比，混播和苜蓿单播增加了芽孢杆菌属、未分类细菌和类芽孢杆菌属的相对丰度。优势真菌属包括未鉴定真菌、被孢霉属、镰刀菌属等。与禾草单播相比，混播和苜蓿单播增加了被孢霉属、镰刀菌属等的相对丰度。

3.5. 功能谱预测及其与土壤理化性质的联系

功能预测显示，细菌功能谱以核心代谢过程为主，不同播种模式间无显著差异。真菌群落主要由腐生和病原菌功能群组成，未定义腐生菌、植物病原菌和动物病原菌相对丰度较高。混播改变了植物病原菌、腐生菌等功能群的相对丰度。Mantel检验表明，土壤硝态氮是影响细菌功能组成的关键因素，而土壤有机碳、铵态氮、水分、碱性磷酸酶和蔗糖酶对真菌功能组成有显著影响。土壤pH与土壤有机碳、全磷、速效磷、水分含量呈显著负相关。

讨论与结论

讨论部分总结：

研究人员针对播种模式对饲草产量、土壤理化性质、土壤微生物群落结构和功能的影响进行了深入讨论。

1. 1.
   播种模式对饲草产量的影响：混播系统通过利用空间互补性和优化资源利用效率，显著提高了饲草生物量产量。苜蓿-猫尾草混播的优势可能源于猫尾草高效吸磷与苜蓿强固氮作用的互补；苜蓿-光滑雀麦草混播的优势则可能源于光滑雀麦草发达的根系改善了土壤结构和保水能力。
2. 2.
   播种模式对土壤理化性质的影响：混播显著提高了土壤有机碳和氮素养分含量。这归因于苜蓿的生物固氮作用、富集了具有产脲酶能力的细菌（芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属）、植物残体归还量增加以及根系分泌物刺激微生物活动加速有机物矿化。两种混播对脲酶活性的影响不同，这可能与真菌群落组成的差异有关。土壤水分与酶活性呈正相关，但酶活性的变化是多种因素（水分、pH、微生物等）综合作用的结果。
3. 3.
   播种模式对土壤微生物群落结构和功能的影响：混播降低了细菌丰富度和真菌均匀度，表明微生物区系向更专门化、功能更优化的状态转变。在门水平，混播增加了厚壁菌门，降低了放线菌门，并富集了被孢霉门。在属水平，富集了芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、被孢霉属等有益类群。功能预测表明，真菌群落在混播中更多地向腐生和病原功能群转变，植物和动物病原菌的相对丰度超过20%，这种转变可能在长期内加速草地退化进程。优化的微生物群落结构是混播系统生态系统功能增强的关键生物学机制。

研究结论（翻译）：

苜蓿-禾草混播显著改善了土壤理化性质并优化了土壤微生物群落结构。具体而言，混播能够招募大量土壤有益细菌和真菌，包括芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属和被孢霉属，有利于提高土壤有机碳、全氮、硝态氮和铵态氮含量以及土壤脲酶活性。这些土壤健康指标的改善，特别是土壤有机碳、硝态氮和铵态氮，与饲草产量的提高密切相关，表明这些因素及相关的微生物群落可能是系统生产力的关键预测因子。这些变化共同改善了生长环境并促进了饲草生产。在大多数情况下，两种苜蓿-禾草组合之间未观察到显著差异，这表明无论与苜蓿配对的特定禾草种类如何，都会发生积极的反馈。这表明豆科-禾本科相互作用本身，而非特定的组合，是系统生产力提升的主要驱动力。这些发现为动态的植物-微生物-土壤反馈提供了科学依据，可用于指导可持续草地的建立和管理。