《Microorganisms》：Lipid Extraction and Cell Disruption Methods for Improving Biodiesel Production by Scenedesmus sp.
M? Pilar Patón Raya,
M? Lourdes Martínez Cartas and
Sebastián Sánchez
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本研究针对鸽A群轮状病毒（PiRVA）检测困难、耗时等问题，建立了一种结合逆转录重组酶辅助扩增（RT-RAA）与CRISPR/Cas12a系统的快速可视化检测方法。该方法特异性强、灵敏度高（最低检测限16.8拷贝/μL），并可结合侧向流动试纸条（LFS）实现结果可视化，为PiRVA的现场快速诊断和流行病学监测提供了有力技术支持。
在禽类养殖业，特别是蓬勃发展的赛鸽和肉鸽产业中，一种名为鸽A群轮状病毒（PiRVA）的病原体正悄然构成威胁。自2016年在澳大利亚首次报道以来，这种病毒在全球多个地区均有发现，它能引发幼鸽疾病综合征（YPDS），导致幼鸽呕吐、腹泻、肝脏坏死甚至死亡，给养殖业造成重大经济损失。然而，传统病毒检测方法如常规PCR，通常需要精密的仪器、较长的检测时间和专业的实验室环境，难以在养殖现场或基层单位快速应用，这极大地制约了对该病毒的早期发现、快速诊断和有效防控。因此，开发一种操作简便、快速、灵敏且无需昂贵设备的新型检测技术，对于有效监测和遏制PiRVA的传播、保障养鸽业健康发展及公共卫生安全至关重要。为了应对这一挑战，研究人员在《Microorganisms》上发表论文，报道了一种创新的检测方法。
本研究主要运用了逆转录重组酶辅助扩增（RT-RAA）、CRISPR/Cas12a系统和侧向流动试纸条（LFS）三种关键技术。研究人员以来自2025年福建省大型鸽场临床样品的鸽A群轮状病毒（PiRVA）为主要研究对象，设计了针对PiRVA VP6基因的特异性引物和CRISPR RNA（crRNA）。通过优化反应条件，将RT-RAA的恒温扩增、CRISPR/Cas12a系统的特异性识别与切割以及侧向流动试纸条的直观显色相结合，建立了RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化快速检测方法，并系统评价了其性能。
原理
该方法的原理是：首先利用RT-RAA对样本中的病毒RNA进行恒温扩增。若样本含有目标病毒基因，则被大量扩增。随后，将扩增产物加入含有Cas12a蛋白、crRNA以及被FAM（荧光素酰胺）和生物素（Biotin）双标记的单链DNA（ssDNA）报告探针的体系中。crRNA会引导Cas12a复合物识别并结合目标序列，激活其反式切割活性，无差别地切割周围的单链DNA报告探针。切割导致报告探针上的FAM与生物素分离。当反应混合物滴加到试纸条上时，完整的报告探针（FAM-ssDNA-Biotin）会被试纸条T线（检测线）上的链霉亲和素通过捕获生物素而截留，使T线显色（阴性结果）。若报告探针被Cas12a切割，FAM端与生物素端分离，T线则无法捕获完整的探针而不显色，仅C线（质控线）显色，表明结果为阳性。
结果
RT-RAA反应的优化
研究人员设计了5对RT-RAA引物进行筛选，最终确定F3/R3为最佳引物对，其扩增片段为249 bp。进一步优化确定RT-RAA的最佳反应条件为温度38°C，时间20分钟。
Cas12a和crRNA浓度的优化
通过测试不同浓度的Cas12a蛋白和crRNA组合，确定了在反应体系中，当Cas12a蛋白的终浓度为25 nmol/L，crRNA的终浓度为15 nmol/L时，检测结果开始呈现阳性。以此作为最优浓度用于后续实验。
特异性、灵敏度和重复性
特异性测试表明，该方法仅能特异性检测PiRVA，与鸽副粘病毒1型（PPMV-1）、鸽梅格里病毒（PiMeV）、鸽腺病毒2型（PiAdV-2）、鸽细小病毒（PiPV）和鸽圆环病毒（PiCV）等其他常见鸽源病毒均无交叉反应，显示出良好的特异性。灵敏度测试结果显示，该方法的最低检测限为16.8 拷贝/μL。重复性测试中，批内和批间重复结果均一致，表明该方法具有良好的重复性。
临床样本检测
利用所建立的方法对2025年采集的56份赛鸽和肉鸽临床组织样本进行检测，并与常规PCR方法及qPCR方法进行比较。结果显示，常规PCR法检出8份阳性（阳性率14.3%），而RT-RAA-CRISPR/Cas12a法和qPCR法均检出11份阳性（阳性率19.6%），且两者检出的阳性样本完全一致。这表明新建立的方法灵敏度高于常规PCR法，与qPCR法相当。检测结果证实，PiRVA感染在我国的赛鸽和肉鸽群体中均有发生，且6月龄以下的鸽子均可感染。
讨论与结论
本研究成功建立了首个用于检测鸽A群轮状病毒（PiRVA）的RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化快速检测方法。该方法具有操作简单、耗时短（总时长约55分钟，包括20分钟扩增、30分钟Cas12a反应和5分钟试纸条读数）、无需昂贵仪器、特异性强、灵敏度高（16.8 拷贝/μL）、重复性好以及结果可视化等显著优点。它非常适合于基层实验室或养殖现场的快速检测应用。通过对临床样本的检测，研究不仅验证了该方法的可靠性，也首次通过分子检测手段确认了PiRVA在我国赛鸽和肉鸽群体中的流行情况，为理解该病毒的流行病学提供了重要数据。该研究为PiRVA感染的诊断、流行病学监测和病原学研究提供了有力的技术支撑，也为基于CRISPR/Cas系统的新一代核酸快速检测技术在兽医诊断领域的应用提供了成功范例。随着相关技术成本的降低，此类方法有望成为未来现场快速分子诊断的重要发展方向。
