《Microorganisms》：Development of RT-RAA-CRISPR/Cas12a-Based Rapid Visual Detection Assay for Pigeon Rotavirus A
Cuiteng Chen,
Yijing Hong,
Zhongjun Tian,
Mengyan Zhang,
Zhen Chen,
Chunhua Zhu,
Lin Lin,
Chunhe Wan and
Yijian Wu
Development of RT-RAA-CRISPR/Cas12a-Based Rapid Visual Detection Assay for Pigeon Rotavirus A
近年来，鸽A型轮状病毒（PiRVA）感染作为一种重要的新发疾病，对养鸽业的健康发展和公共卫生构成了重大威胁。为了应对这一挑战，本研究旨在开发一种准确、快速且便捷的检测方法，用于该病毒的监测与早期诊断。研究团队基于PiRVA VP6基因ORF序列特征，设计了crRNA和逆转录重组酶辅助扩增（RT-RAA）引物，首次结合RT-RAA技术与侧向层析试纸条（LFS），建立了PiRVA的RT-RAA-CRISPR/Cas12a快速检测方法。
该方法表现出优异的性能，能够特异性检测PiRVA，与其他常见鸽源病毒无交叉反应。其最低检测限达到16.8 copies/μL，批内和批间重复试验结果一致。在对2025年采集的56份赛鸽和肉鸽临床组织样本的分析中，RT-RAA-CRISPR/Cas12a法的阳性检出率高于已建立的常规PCR法，证实了PiRVA在中国赛鸽和肉鸽群体中的流行。综上所述，该研究建立的检测方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性，且结果可视化的特点使其非常适合现场应用，为PiRVA的流行病学监测和病原学研究提供了有力的技术支撑。
1. Introduction
轮状病毒（RV）是一种属于Reovirales目、Sedoreoviridae科、Rotavirus属的双链RNA（dsRNA）病毒。RV颗粒呈二十面体结构，由三层组成，直径约70–85 nm，无包膜，在电子显微镜下呈车轮状。其基因组由11个长度不同的双链RNA节段组成，片段长度范围为663至3302 bp，编码至少6种结构蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4、VP6和VP7）和5或6种非结构蛋白（NSP1、NSP2、NSP3、NSP4和NSP5/NSP6）。其中，VP1和VP3两种核心蛋白直接与基因组相关，VP2构成核心壳，病毒粒子的中间蛋白层由VP6构成，最外层蛋白层则由VP4和VP7构成。根据VP6的抗原特性和基因组RNA节段的凝胶电泳（PAGE）图谱，RV可分为A、B、C、D、F、G、H、I和J共9个病毒种或血清群。现有研究表明，A型轮状病毒（RVA）是人类和动物中主要的流行和致病株，主要感染幼年宿主，临床特征主要为腹泻。早在20世纪80年代就有从鸽粪中分离出RV的报道，但此后关于鸽RV的研究相对较少。直到2016年，在澳大利亚出现呕吐、腹泻和肝坏死症状的鸽子中发现了G18P[17]基因型的PiRVA。2017年，德国、比利时和丹麦报道了类似疾病，2018年的回顾性分析表明该病在欧洲实际已存在30年。Rubbenstroth等人随后报道PiRVA基因型G18P[17]是幼鸽病综合征（YPDS）的主要病因。此外，美国、波兰和台湾也报告了PiRVA感染病例。作为一种近年来的重要新发疾病，PiRVA感染对养鸽业的健康发展构成了重大威胁，因此开发准确、快速的检测方法至关重要。
成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关Cas蛋白为细菌和古菌提供了针对病毒的适应性免疫。当细菌被病毒感染时，会处理病毒的特征序列并通过CRISPR储存，以便再次感染时能快速识别和抵抗。CRISPR/Cas系统不仅适用于基因编辑，其Cas蛋白的反式切割活性还可用于病原体核酸检测。为了检测反式切割的发生，单链DNA一端可标记荧光基团（如FAM），另一端标记淬灭基团（如BHQ1），若单链DNA被切割则可检测到荧光信号。此外，为便于现场应用并减少对仪器的依赖，研究人员使用FAM和生物素标记单链DNA，开发了通过免疫层析试纸条可视化读取结果的方法。CRISPR/Cas系统对核酸检测灵敏度较低，需与核酸扩增技术联用。重组酶辅助扩增（RAA）是一种在恒温（37~42 °C）下快速扩增核酸的方法，主要依靠三种酶：重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶。
本研究利用RT-RAA的便捷性与CRISPR/Cas系统特异性的互补优势，并结合侧向层析试纸条（LFS），首次建立了PiRVA的RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化快速检测方法。该方法具有操作简单、耗时短、特异性好、灵敏度高且不依赖昂贵仪器的优点，为PiRVA的流行病学监测和病原学研究提供了技术支持。
2. Materials and Methods
2.1. Virus and Samples
病毒株和样本包括经鉴定的鸽A型轮状病毒（PiRVA, FJ21109）、鸽副粘病毒1型（PPMV-1, FJ2126）、鸽巨环病毒（PiMeV, FJ2515）、鸽腺病毒2型（PiAdV-2, FJ21125）、鸽细小病毒（PiPV, FJ2163）和鸽圆环病毒（PiCV, FJ21152），均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所保存。用于临床检测的56份样本（主要来自福建省大型鸽场）为2025年送检死亡鸽的肝脏和肠道组织。病毒核酸通过EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取。
2.2. Design of RT-RAA Primers and crRNA
下载NCBI数据库中所有具有完整ORF的VP6基因序列进行分析。基于VP6序列特征及恒温扩增引物设计原则，设计了crRNA及对应的5对RT-RAA引物，其中R1和R2配对同一上游引物F。设计的RT-RAA引物长度为31 bp，扩增片段大小在120至250 bp之间。RT-RAA引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，PiRVA特异性crRNA由深圳翌圣生物科技有限公司合成。
2.3. Optimization of RT-RAA Reactions Optimization of the Reaction Conditions for RT-RAA
按照RT-RAA扩增试剂说明书配制反应体系（总体积20 μL）：10 μL复水溶液（2×），0.5 μL上下游引物（20 μmol/L），2 μL模板RNA，5 μL ddH2O和2 μL启动子（10×）。将反应体系置于恒温水浴锅中进行筛选。首先筛选反应引物，随后优化反应温度（35 °C、36 °C、37 °C、38 °C、39 °C、40 °C）和反应时间（15 min、20 min、25 min、30 min、35 min、40 min）。以添加ddH2O的反应体系作为阴性对照，试剂盒自带阳性模板作为阳性对照。通过3%琼脂糖凝胶电泳观察RT-RAA产物，并由凝胶成像系统成像，据此确定最佳引物和反应条件。
2.4. Optimization of CRISPR/Cas12a Reactions
按照Cas12a反应试剂说明书配制20 μL反应混合物：2 μL Cas12a反应缓冲液（10×），1 μL Cas12a蛋白（1 μmol/L），0.25 μL Cas12a报告探针（4 μmol/L），1 μL crRNA（1 μmol/L），1 μL RT-RAA扩增产物，加ddH2O至总体积20 μL。采用不同终浓度的Cas12a蛋白（5 nmol/L、15 nmol/L、25 nmol/L、35 nmol/L和45 nmol/L）和crRNA（5 nmol/L、15 nmol/L、25 nmol/L、35 nmol/L和45 nmol/L）组合，以PiRVA阳性RT-RAA扩增产物为模板进行反应。反应混合物置于水浴锅中37 °C孵育30 min。反应结束后取2 μL产物，加入78 μL稀释液稀释。将侧向层析试纸条（购自深圳翌圣生物科技有限公司）放入稀释后的反应混合物中，5 min内观察试纸条结果。若试纸条出现一条带为阳性，出现两条带为阴性。
2.5. Specificity of RT-RAA-CRISPR/Cas12a Detection Reactions
对PiRVA、PPMV-1、PiMeV、PiAdV-2、PiPV和PiCV进行优化后的RT-RAA扩增，随后在优化后的CRISPR/Cas12a反应条件下以上述扩增产物为模板进行检测。以ddH2O为模板的反应体系作为阴性对照，试剂盒自带阳性模板作为阳性对照。通过观察侧向层析试纸条结果检验方法的特异性。
2.6. Sensitivity of RT-RAA-CRISPR/Cas12a Detection Reactions
由生工生物工程（上海）股份有限公司人工合成PiRVA的VP6 RNA（毒株X-05, GenBank编号MN481635.1）。将RNA进行10倍梯度稀释，共9个稀释度，浓度范围从1.68 × 108到1.68 × 100copies/μL。以稀释度为1.68 × 104至1.68 × 100copies/μL的RNA为模板，采用优化后的检测方法进行检测。以ddH2O为模板的反应体系作为阴性对照，试剂盒自带阳性模板作为阳性对照。通过观察侧向层析试纸条结果检验方法的灵敏度。
2.7. Repeatability of RT-RAA-CRISPR/Cas12a Detection Reactions
采用两个浓度的PiRVA RNA（1.68 × 106copies/μL和1.68 × 103copies/μL）进行RT-RAA-CRISPR/Cas12a的重现性试验，每个浓度重复3次。以ddH2O为模板的反应体系作为阴性对照，试剂盒自带阳性模板作为阳性对照。通过观察侧向层析试纸条结果进行批内和批间重复性验证。
2.8. Clinical Samples Detection
采用建立的RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测方法对2025年采集的56份赛鸽和肉鸽临床组织样本进行PiRVA检测。同时，采用实验室前期建立的常规PCR方法（上游引物PiRVAF: CAAACTGGAGGTATAGGCAACTTG；下游引物PiRVAR: TGCYACTCCAGGTGTCATATTTG；PCR产物大小777 bp）和参考文献描述的qPCR方法进行平行检测，以评价该方法的临床应用效果。PCR检测阳性的产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行Sanger测序。
3. Results
3.1. Principle of the RT-RAA-CRISPR/Cas12a Visual Rapid Detection Method
RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化快速检测方法的原理简述如下：以待测样本提取的核酸为模板进行RT-RAA反应，若样本含靶基因则大量扩增，反之无扩增。Cas12a反应体系含有标记荧光酰胺（FAM）和生物素的单链DNA探针。将Cas12a反应混合物滴加至试纸条后，试纸条上的胶体金偶联FAM抗体与单链DNA探针结合，形成5'-Gold-Ab-FAM-ssDNA-Biotin-3'检测探针。测试（T）线上的链霉亲和素捕获生物素标记的检测探针，形成可见的金线；质控（C）线上的二抗捕获FAM金标抗体，形成可见的金线。若待测样本含靶基因，Cas12a介导crRNA靶向并切割靶序列，激活Cas12a的反式切割活性，将ssDNA探针切断，FAM金标抗体无法停留在T线，T线无色带，仅C线有色带，判为阳性。若待测样本不含靶基因，Cas12a反式切割活性不被激活，单链DNA探针保持完整，FAM金标抗体通过与完整探针结合而停留在T线，T线和C线均有色带，判为阴性。若C线无条带或C、T线均无条带，则试纸条无效。
3.2. Optimization of RT-RAA Reactions
本研究设计并筛选了5对靶向PiRVA的RT-RAA引物。电泳结果显示引物对F3/R3有明显的特异性扩增条带，片段大小为249 bp，因此选择F3/R3作为PiRVA的RT-RAA扩增引物。在反应温度优化中，设置35 °C至40 °C，结果显示在37 °C、38 °C、39 °C和40 °C均能扩增出目标条带，但在38 °C时扩增效果最佳。在反应时间优化中，设置15 min至40 min，结果显示在15 min至40 min均能扩增出目标条带，20 min后条带亮度变化不大，为缩短时间，确定最佳反应时间为20 min。
3.3. Optimization of Cas12a and crRNA Concentrations
通过设置不同Cas12a蛋白和crRNA浓度组合进行测试，试纸条一条带为阳性，两条带为阴性。结果显示，当反应体系中Cas12a蛋白终浓度为25 nmol/L、crRNA终浓度为15 nmol/L时，试纸条结果开始呈阳性。为节约成本，确定Cas12a蛋白和crRNA的最佳终浓度分别为25 nmol/L和15 nmol/L。因此后续实验均采用此浓度的crRNA和Cas12a进行检测。优化后的CRISPR/Cas12a反应体系（20 μL）组成为：2 μL Cas12a反应缓冲液（10×），0.5 μL Cas12a蛋白（1 μmol/L），0.25 μL Cas12a报告探针（4 μmol/L），0.3 μL CrRNA（1 μmol/L），1 μL RAA扩增产物和15.95 μL ddH2O。
3.4. Specificity, Sensitivity, and Repeatability
特异性试验结果显示，建立的检测方法仅能特异性检测PiRVA，与其他鸽源病毒（如PPMV-1、PiMeV、PiAdV-2、PiPV和PiCV）无交叉反应，方法特异性良好。灵敏度测试表明，RT-RAA-CRISPR/Cas12a联合试纸条检测法的最低检测限为16.8 copies/μL。重复性试验结果显示，各浓度批内重复试验结果一致，各浓度批间重复试验结果也一致，表明本研究的PiRVA检测方法具有良好的重现性。
3.5. Detection of Clinical Samples
临床样本检测结果显示，常规PCR法检测出8份阳性样本，这些阳性PCR产物的测序结果也为阳性，PiRVA阳性样本百分比为14.3%（8/56）。RT-RAA-CRISPR/Cas12a法检测出11份PiRVA阳性样本，阳性率为19.6%（11/56）。qPCR法也检测出11份PiRVA阳性样本（阳性样本的Ct值分别为21.09 ± 0.24、33.12 ± 0.48、25.21 ± 0.32、24.40 ± 0.30、23.06 ± 0.25、32.24 ± 0.43、21.18 ± 0.34、32.06 ± 0.52、23.39 ± 0.24、19.00 ± 0.19和23.98 ± 0.33），阳性率为19.6%（11/56）。此外，常规PCR法阳性的样本在RT-RAA-CRISPR/Cas12a法和qPCR法中均为阳性，且RT-RAA-CRISPR/Cas12a法检出的阳性样本与qPCR法完全一致。在3种方法均阳性的8份样本中，3份来自1月龄以下鸽子，2份来自2月龄以下鸽子，其余3份分别来自3月龄、4月龄和6月龄鸽子。在这8份样本中，6份来自具有肠炎临床表现的死亡鸽子。在赛鸽和肉鸽中均检测到PiRVA阳性。PCR法检测赛鸽和肉鸽样本阳性率分别为17.6%和12.8%，而RT-RAA-CRISPR/Cas12a法和qPCR法检测赛鸽和肉鸽样本阳性率相同，分别为23.5%和17.9%。临床样本检测结果表明，建立的RT-RAA-CRISPR/Cas12a方法可靠，其灵敏度高于常规PCR法，与qPCR法灵敏度相近。
4. Discussion
RV是导致幼龄动物、婴幼儿严重急性胃肠炎的主要病原体之一，临床表现主要为呕吐、腹泻和脱水，经粪口途径传播。RV是一种人畜共患病原体，宿主范围广，可跨物种传播，已从多种患病动物中分离得到。RV常成为并发或继发性腹泻疾病的病因，对人类健康和畜牧业发展构成巨大威胁。早期关于PiRVA感染的报道较少，随着养鸽业规模化、集约化的快速发展以及养殖总量和密度的增加，近年来关于PiRVA感染的报道日益增多。加之信鸽比赛、观赏鸽展览等鸽子贸易流通频繁，不仅增加了鸽子间PiRVA传播的风险，也为PiRVA病毒重组提供了有利环境，增加了该病防控失败的风险。据报道，德国观赏鸽展览后，参展鸽子爆发了由PiRVA感染引起的疾病，其他研究也表明PiRVA在参展鸽中流行率较高，说明展览是该病原体传播的危险因素。作为一种重要的新发疾病，PiRVA感染对养鸽业健康发展和公共卫生构成重大威胁，因此建立该病毒的快速检测方法对疾病监测和早期诊断至关重要。
基于CRISPR/Cas12a系统的核酸检测技术具有高特异性优势，已广泛应用于人类及牛、猪、鸡、鸭、鹅等畜禽的病原体检测，正在改变传统的病毒核酸检测模式，是一种全新的病毒核酸检测技术。结合等温扩增等方法，CRISPR/Cas核酸检测系统可通过反式切割活性放大信号，降低对仪器的要求，使现场特异性和快速检测成为现实。与传统诊断方法相比，CRISPR/Cas系统非常适合开发性能更高、现场快速的检测方法，在资源有限的情况下更具优势。本研究建立了基于CRISPR/Cas12a系统结合RT-RAA和LFS的PiRVA快速检测方法，该方法操作简便、耗时短，RAA反应20 min，CRISPR/Cas12a反应30 min，试纸条5 min内即可观察结果，无需昂贵仪器，特异性强，仅检测PiRVA不与其他常见鸽病原交叉反应，灵敏度高，检测限达16.8 copies/μL，高于常规PCR法，三次重复实验结果良好且具有可视化特点，非常适用于现场检测，为PiRVA的流行病学监测和病原学研究提供了技术支持。
YPDS是幼鸽常见的季节性急性肠道疾病，临床表现为呕吐、腹泻、嗜睡、厌食和体重减轻，传播迅速，发病率高达100%，死亡率在零到40%以上。鸽子腹泻后生产性能下降甚至死亡，赛鸽腹泻常导致其飞行能力下降和经济价值损失，是严重影响养鸽业的主要疾病之一。既往研究表明YPDS由多种因素引起，虽提出过鸽圆环病毒和鸽腺病毒等病原体，但均无法通过实验复制该病。Rubbenstroth等人在患有腹泻、呕吐、肝坏死和猝死症状的欧洲家鸽中发现新型PiRVA变异株，通过动物感染实验证明PiRVA感染可引起鸽子腹泻和死亡，因此提出PiRVA是幼鸽病综合征的主要病原。本研究临床样本检测结果也显示，大多数PiRVA阳性样本来自具有肠炎临床表现的死亡鸽子。尽管本研究临床样本来源有限，但结果证实中国赛鸽和肉鸽群体中均发生PiRVA感染，且6月龄以下的鸽子均可感染。至于不同年龄鸽子感染PiRVA后的临床症状是否存在差异，尚需进一步研究。
肉鸽养殖业经过数十年发展，已成为仅次于鸡、鸭、鹅的第四大家禽养殖业。目前中国已成为全球最大的肉鸽生产国，年产量约6.8亿只，占全球产量的80%左右。据中国信鸽协会统计，2025年全国信鸽足环发放总量超过3000万枚，赛鸽产业正在迅速发展。虽然行业前景广阔，但养鸽业仍面临多重挑战，其中疫病防控压力是最重要的挑战之一。疾病的及时监测和快速诊断极大依赖于检测方法。本研究建立的鸽群轮状病毒RT-RAA-CRISPR/Cas12a快速检测方法仅包含恒温扩增和CRISPR/Cas12a反应过程，流程简单，仅需移液器和恒温水浴锅等简单仪器，无需PCR仪、凝胶成像系统和荧光定量PCR仪等昂贵设备，可在大多数普通基层实验室操作。虽然该方法目前在试剂成本上与常规分子生物学方法相比优势不明显，但随着技术发展，试剂生产成本将持续降低，相信基于CRISPR/Cas系统的核酸检测技术将成为下一代核酸检测的重要发展方向。
5. Conclusions
总之，研究团队首次开发了针对PiRVA的快速、准确的RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化检测方法。该方法具有优异的特异性、灵敏度和重复性，可用于快速现场检测，为PiRVA感染的诊断、流行病学监测和病原学研究提供了技术支撑。同时，研究也证实了中国赛鸽和肉鸽群体中均存在PiRVA感染。
