一种保守的糖基基序可诱导针对人畜共患病原体猪链球菌的广泛反应性功能性抗体

《SCIENCE ADVANCES》：A conserved glycan motif induces broadly reactive functional antibodies against the zoonotic pathogen Streptococcus suis

　　

猪链球菌是一种在很大程度上被忽视但新发的人畜共患细菌病原体，对动物福利、抗生素耐药性发展和人类健康具有全球性影响。目前尚无有效的疫苗可用。在本研究中，研究人员通过基因缺失和（异源）互补、凝集素染色、聚糖组成分析和专用核磁共振（NMR）波谱学，鉴定并表征了致病性猪链球菌菌株中两种细胞壁多糖变体的功能和结构。这两种聚糖变体均为阴离子聚合物，由于糖基转移酶基因的等位基因变异，其侧链中是否存在葡萄糖而存在差异。该可变糖基转移酶的缺失揭示了一个相同的聚糖“核心”，并影响了猪链球菌的形态和溶菌酶抗性。用此核心结构域免疫猪，可诱导产生能够识别抗原性多样的致病性猪链球菌菌株的抗体，并能在有荚膜的致病性猪链球菌菌株表面诱导补体沉积。本研究为开发新一代糖基化偶联疫苗提供了有价值的见解，即单一聚糖靶点可针对新发人畜共患病原体猪链球菌提供保护。

研究背景与目的

猪链球菌是一种全球性人畜共患病原体，可导致猪的严重感染（如脑膜炎、败血症、关节炎），造成高死亡率和经济损失。同时，它也是亚洲部分地区成人细菌性脑膜炎的主要病因。其感染是猪场抗生素使用的关键驱动因素，促进了多重耐药菌株的出现。目前尚无有效疫苗，而传统的基于荚膜多糖（Capsular Polysaccharide, CPS）的糖基化偶联疫苗仅能提供血清型特异性保护，且猪链球菌存在29种CPS血清型及频繁的荚膜转换现象，限制了其应用。因此，急需一种能够提供广谱保护的疫苗策略。革兰氏阳性菌表面高密度表达细胞壁锚定的聚糖聚合物，如链球菌属的鼠李糖丰富多糖（Rhamnose-Rich Polysaccharide, RPS），其结构变异通常小于CPS。研究人员假设猪链球菌表达的RPS分子也具有相对保守的结构，可能成为广谱疫苗的潜在靶点。为此，本研究旨在表征人畜共患病原体猪链球菌中RPS的生物合成基因簇、糖基连接模式及功能，以探索其作为通用疫苗候选抗原的潜力。本研究成果发表在《SCIENCE ADVANCES》上。

主要技术方法概述

本研究采用了多学科交叉的技术体系。首先，通过对1719个公开的猪链球菌基因组进行生物信息学分析，鉴定了RPS及其前体dTDP-鼠李糖的生物合成基因簇，并分析了其在种群中的保守性。其次，利用同源重组和质粒互补技术构建了系列基因缺失及回补菌株（如ΔsrpL、ΔsrpP、ΔCPS等），用于功能研究。通过凝集素染色、气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术进行糖组成和连接分析，以及核磁共振（NMR）波谱学（包括¹H,¹³C-HSQC、¹H,³¹P-HMBC、NOESY等）解析了两种RPS变体及其突变体多糖的详细化学结构。此外，利用流式细胞术分析了抗体结合、补体沉积（C3b）和中性粒细胞吞噬功能，并通过扫描/透射电子显微镜、生长曲线和链长测量评估了RPS侧链对细菌生物学表征的影响。最后，通过点击化学（CuAAC）将保守的RPS核心结构域与载体蛋白CRM₁₉₇偶联，制备糖基化偶联疫苗，并用其免疫仔猪，评估其免疫原性及诱导抗体的广谱反应性和功能。

研究结果

1. 鉴定猪链球菌dTDP-鼠李糖和RPS生物合成基因簇

研究人员在参考菌株P1/7中鉴定出一个包含14个基因的假定RPS生物合成簇（srpBCDEGIJKLMNPQR）和一个独立的5基因dTDP-鼠李糖生物合成簇。基因srpO（编码UDP-GlcNAc: undecaprenol-phosphate GlcNAc-phosphate转移酶）位于该簇之外，被认为是生物合成的起始和必需步骤。对1719个基因组的分析显示，dTDP-鼠李糖生物合成基因普遍存在且保守，而RPS基因簇的组成存在变异，特别是在致病谱系中，糖基转移酶编码基因srpC和srpL存在等位基因多样性。

2. 糖基转移酶SrpC和SrpL在致病性猪链球菌谱系中表现出等位基因多样性

在致病谱系中，srpC和srpL表现出序列变异。凝集素染色实验表明，ST-1菌株S10和ST-20菌株861160的RPS组成不同。删除srpL可改变凝集素结合模式，且同源基因回补可恢复表型，而异源回补则不能，证明srpL的遗传差异导致了RPS的结构差异。删除侧链生物合成关键基因srpP导致半乳糖（Gal）/N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）末端表位丢失，并暴露出N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）表位。

3. 猪链球菌RPS具有两种结构变体，但包含一个保守的聚糖基序

糖组成和连接分析证实，S10的RPS包含Rha、Gal和GlcNAc，而861160的RPS额外含有Glc。删除srpL影响了Gal/Glc的含量，而删除srpP后，两个菌株的RPS均只含有Rha和GlcNAc，呈现出相同的糖组成，这揭示了两种RPS变体共享一个由Rha和GlcNAc构成的核心骨架。NMR结构解析进一步确定，ΔsrpP突变体的RPS骨架是由→2)-α-L-Rha_p-(1→2)-α-L-Rha_p-(1→6)-α-D-Glc_pNAc-(1→)三糖重复单元构成的线性多糖。因此，ΔsrpPRPS代表了一个保守的聚糖基序。

4. 甘油磷酸与ST-1菌株S10和ST-20菌株861160的不同糖相连

磷酸分析和NMR波谱表明，两种野生型RPS变体均带有负电荷，含有磷酸二酯键连接的甘油磷酸（GroP）修饰。在S10中，GroP连接在半乳糖（Gal）的O6位；而在861160中，GroP连接在葡萄糖（Glc）的O6位。删除srpL或srpP后，磷酸修饰丢失，表明由SrpL转移的末端Gal（S10）或Glc（861160）是GroP的受体。

5. RPS侧链对猪链球菌生物学特性很重要

删除srpL或srpP均能增加猪链球菌对溶菌酶的抗性。ΔsrpL突变体生长减缓且链长增加，ΔsrpP突变体（仅表达RPS三糖骨架）生长正常但链长显著增加，并出现细胞聚集。显微镜观察显示，ΔsrpP突变体细胞形态异常。这些结果表明RPS侧链对猪链球菌的形态、链形成和生长有重要作用。

6. RPS核心基序可在仔猪中诱导功能性IgG抗体，并能与多样化的致病性和有荚膜猪链球菌分离株发生交叉反应

研究人员从861160 ΔCPSΔsrpL突变体中纯化出保守的RPS核心结构域，通过点击化学与CRM₁₉₇偶联制备糖基化偶联疫苗，并免疫仔猪。免疫后，58.3%的仔猪产生了针对免疫原聚糖的IgG应答。这些抗体不仅能识别纯化的来自S10和861160的野生型、ΔsrpL和ΔsrpPRPS，还能与多种不同遗传背景、CPS血清型的致病性猪链球菌菌株（包括有荚膜菌株）结合。虽然荚膜的存在降低了抗体与细菌表面的结合，但高滴度应答者的血清能显著促进补体C3b在荚膜菌表面的沉积，并能增强猪中性粒细胞对RPS包被微珠的吞噬作用。这表明由RPS核心域诱导的抗体具有广谱反应性和功能活性。

讨论与结论总结

本研究首次对猪链球菌致病谱系中两种RPS变体进行了分子层面的解析，定义了其生物合成基因簇并阐明了糖基连接模式。研究表明，RPS侧链对细菌的生长、形态和溶菌酶抗性至关重要。更重要的是，研究发现了两种RPS变体共享一个保守的聚糖核心基序。用该核心基序免疫仔猪，可诱导产生能识别多种致病性猪链球菌菌株的功能性抗体，且这些抗体在荚膜存在的情况下仍可发挥作用。

研究结论翻译：“总之，我们鉴定并表征了来自致病性猪链球菌的两种结构RPS变体的生物合成基因簇和糖基连接模式。此外，我们证明了RPS侧链对猪链球菌的生长和形态很重要。这两种RPS变体共享一个核心聚糖结构域，该结构域可诱导功能性抗体，这些抗体能与多种致病性猪链球菌菌株发生反应，这为其作为针对人畜共患病原体猪链球菌的通用疫苗组分进行进一步探索提供了依据。”