《SCIENCE ADVANCES》：MUTE drives asymmetric divisions to form stomatal subsidiary cells in Crassulaceae succulents
编辑推荐：
本文针对CAM多肉植物气孔辅助细胞（SCs）的发育与功能这一长期悬而未决的难题，以Kalancho? laxiflora为模型展开研究。研究人员通过基因编辑、活体成像、钾离子示踪和转录组学分析，揭示了转录因子KlaxMUTE驱动额外的不对称分裂以形成SCs的独特机制。该工作确立了K. laxiflora作为多肉植物发育模型，并阐明了CAM植物中创新性气孔形态的遗传基础，对理解植物水分高效利用机制具有重要意义。
植物在应对陆地干旱环境的漫长演化中，发展出了诸多精巧的“生存策略”。其中，气孔——这些叶片上可开合的微小孔隙，是植物与环境进行气体交换和水分散失的关键门户。然而，在极度缺水的环境中，仅仅依靠普通的气孔结构是远远不够的。于是，一些植物进化出了景天酸代谢(Crassulacean Acid Metabolism, CAM)这种高度节水的光合模式，它们主要在夜间打开气孔吸收二氧化碳，白天则关闭气孔以减少水分蒸腾。有趣的是，许多具有CAM光合作用的多肉植物，其气孔周围还围绕着一种特殊的细胞——辅助细胞(Subsidiary Cells, SCs)，它们通常呈大小不等的圆环状排列。长期以来，这些辅助细胞的功能是什么？它们是如何发育而来的？其背后又隐藏着怎样的遗传密码？这些问题一直是植物发育生物学和进化生物学中未解的谜题。
为了解开这些谜团，研究人员将目光投向了一种名为Kalancho? laxiflora的景天科多肉植物。与拟南芥等没有辅助细胞的模型植物不同，K. laxiflora的气孔由两个肾形的保卫细胞(Guard Cells, GCs)和三个大小不均的辅助细胞共同组成。研究人员决心以它为新的模型，深入探索CAM多肉植物中气孔辅助细胞的奥秘。这项重要的研究成果发表在《SCIENCE ADVANCES》期刊上。
研究人员在开展这项研究时，综合运用了多项关键技术。他们首先为K. laxiflora牛津植物园品种测序了基因组，并建立了高效的基于组织培养的遗传转化体系和优化的园艺培养流程，将其生命周期缩短至6个月以内，从而将其确立为一种可遗传操作的发育模型系统。在功能研究层面，他们利用CRISPR-Cas9基因编辑技术创建了klaxmute1;klaxmute2双突变体。通过活细胞时间推移成像技术，他们直观地追踪了气孔发育的完整动态过程。此外，利用钾离子沉淀染色技术，他们可视化了气孔开闭过程中钾离子在保卫细胞和辅助细胞之间的穿梭。通过构建KlaxMUTE1和KlaxMUTE2的转录和翻译报告基因株系，并结合共聚焦显微镜成像，精确解析了这两个基因的表达时空动态。最后，通过对KlaxMUTE1过表达株系进行RNA测序(RNA-seq)，系统分析了其下游的转录组变化。
K+shuttling during stomatal movements suggests SCs to be functionally relevant
研究人员首先探讨了辅助细胞的功能。他们用脱落酸(ABA)和壳梭孢素(Fusicoccin)分别诱导气孔关闭和开放，然后进行钾离子(K+)沉淀染色。结果发现，当气孔关闭时，K+主要存在于辅助细胞中；而当气孔打开时，K+则主要转移到了保卫细胞中。这表明，与禾本科植物类似，K. laxiflora的辅助细胞也作为“帮手细胞”，通过穿梭渗透调节物质来支持由膨压驱动的气孔运动，具有重要的生理功能。
Additional rounds of asymmetric meristemoid divisions generate SCs
接下来，研究人员利用表达质膜标记蛋白的株系，对发育中的叶片进行了长达10天的时间推移成像。他们清晰地观察到一个初始的分生组织母细胞经历一系列不对称细胞分裂(Asymmetric Cell Divisions, ACDs)。这个分裂过程分为两个明显阶段：第一阶段，分生组织1产生气孔谱系地面细胞；第二阶段，分生组织2进行额外的三轮不对称分裂，最终产生三个辅助细胞。此后，分生组织转变为保卫母细胞，并进行一次对称分裂，形成一对保卫细胞。这表明辅助细胞是由额外的、拟南芥中不存在的不对称分裂产生的。
klaxmute1;klaxmute2 cannot form functional stomatal complexes and shows aberrant asymmetric divisions
在拟南芥中，转录因子MUTE的功能是终止不对称分裂，促使分生组织转变为保卫母细胞。然而，在K. laxiflora中，MUTE基因发生了复制(KlaxMUTE1和KlaxMUTE2)。研究人员通过基因编辑获得了klaxmute1;klaxmute2双突变体。该突变体幼苗生长停滞，无法形成成熟气孔，并出现了异常的、破坏斐波那契螺旋分裂模式的横向分裂，这表明KlaxMUTEs在调控不对称分裂模式中具有超越拟南芥AtMUTE的新功能。
KlaxMUTE1 and KlaxMUTE2 reporter genes are expressed during SC divisions
通过构建并观察KlaxMUTE1和KlaxMUTE2的报告基因表达，研究人员发现，这两个基因的启动子在分生组织1向分生组织2转换时开始有微弱表达，并在整个产生辅助细胞的分生组织2分裂阶段以及保卫母细胞阶段持续活跃。翻译报告蛋白的时程成像进一步证实，KlaxMUTE1和KlaxMUTE2蛋白在形成辅助细胞的不对称分裂之前、之中和之后均有表达。这与它们在辅助细胞形成过程中的作用高度吻合。
Overexpression of KlaxMUTEs induces ectopic asymmetric divisions
在拟南芥中过表达AtMUTE会导致叶片表皮几乎全部由成对的保卫细胞组成。然而，在K. laxiflora中过表达KlaxMUTE1或KlaxMUTE2，则导致了完全不同的表型：叶片表皮出现了大量的小细胞，拼图形状的路面细胞减少，总细胞密度显著增加，并且超过35%（KlaxMUTE1过表达）或20%（KlaxMUTE2过表达）的气孔复合体具有超过三个辅助细胞。这强有力地表明，KlaxMUTEs的功能是诱导一个形成辅助细胞的不对称分裂程序，而非像拟南芥中那样终止分裂。
The functional role of KlaxMUTEs is species-context dependent
为了测试KlaxMUTEs促不对称分裂的功能是否是蛋白质本身固有的，研究人员进行了跨物种过表达实验。结果显示，在拟南芥中过表达KlaxMUTE1或KlaxMUTE2，只会产生成对的保卫细胞，而不会诱导额外的不对称分裂。反之，在K. laxiflora中过表达拟南芥的AtMUTE，也会诱导额外的不对称分裂。这表明MUTE蛋白的功能具有物种背景依赖性，其下游的遗传程序在不同物种中发生了分化。
KlaxMUTE1 induces meristemoid2-specific cell division and identity programs
对KlaxMUTE1过表达株系的转录组分析揭示了下游的遗传变化。与拟南芥中AtMUTE过表达促进保卫细胞分化因子（如AtFAMA）不同，KlaxMUTE1过表达下调了同源基因KlaxFAMA2和KlaxFLP的表达。同时，它特异性地上调了与不对称分裂相关的CycD3同源基因。这表明KlaxMUTE1激活了一个延迟保卫细胞分化、同时促进不对称分裂以形成辅助细胞的特定遗传程序。
讨论与结论
这项研究揭示了一个重要的进化创新机制：在单子叶禾本科植物和双子叶景天科多肉植物这两个演化距离甚远的谱系中，核心气孔转录因子MUTE独立地演化出相似的新功能——驱动不对称分裂以形成辅助细胞，尽管它们的辅助细胞在起源上分别是外生的和周生的。在K. laxiflora中，KlaxMUTE1和KlaxMUTE2通过激活特定的细胞周期程序（如特定CycD3基因）并延迟保卫细胞分化程序，控制了一个额外的放大分裂程序，从而产生了功能性的、大小不等的辅助细胞。
重要的是，MUTE蛋白的这种功能转换并非由其自身氨基酸序列的根本变化决定，而是由其下游物种特异的顺式调控元件和遗传程序的重新布线所驱动。这为理解进化过程中如何通过相对“经济”的调控网络改变来产生新的复杂性状提供了典型案例。
在生理意义上，辅助细胞通过钾离子穿梭参与气孔运动的调控，很可能在CAM植物夜间开孔、白天紧密关闭以极致节约水分的策略中扮演了关键角色。其相对保卫细胞更大的体积和在气孔关闭时储存钾离子的特点，暗示了它们在高效实现气孔闭合、减少日间蒸腾方面的重要性。
综上所述，本工作不仅成功地将K. laxiflora确立为研究多肉植物发育和CAM生物学的强大实验模型，更重要的是，它深入解析了景天科植物中形成功能性气孔辅助细胞的精细遗传机制。这项研究为未来从发育和生理角度进一步剖析CAM植物高效水分利用的解剖学基础，乃至为在农业系统中设计或改造作物的节水策略，提供了宝贵的遗传资源和理论基础。
