《mSphere》：A heterologous marker-free selection approach for CRISPR/Cas9-based gene editing in the malaria parasite Plasmodium falciparum
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本文为解决现有基因编辑方法依赖外源药物筛选标记导致迭代编辑受限的难题，研究人员开发了一种称为 CRISPR/Cas9pyrR的新型基因编辑策略。该策略通过共转染两个质粒，在对目的基因进行编辑的同时，将乙胺嘧啶（PYR）抗性突变引入内源性pfdhfr-ts基因，从而实现不依赖外源标记的转基因寄生虫筛选。研究人员成功利用该方法对核膜相关蛋白 PfGEX1 和核孔蛋白 PfNUP116 进行了 C 端标记，并揭示了它们在配子体发育中的特异性表达和动态定位，为研究疟原虫有性分化的核周区动态组成变化提供了新工具和新见解。这项工作极大地补充了恶性疟原虫研究的遗传学工具箱，并为连续遗传改造提供了有效新方法。
疟疾，这个由恶性疟原虫引发的古老疾病，至今仍在全球范围内，尤其是撒哈拉以南非洲地区，对人类健康构成巨大威胁。尽管科学家们已与它斗争了上百年，但要开发出高效疫苗和全新作用机制的药物，我们仍需深入了解这种寄生虫如何在人体内生存、复制和传播。近年来，被誉为“基因剪刀”的 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，已成为研究恶性疟原虫基因功能、寻找新药靶点的革命性工具。然而，这项技术在疟原虫中的应用却面临着一个独特而棘手的挑战：筛选工具太少。就像在一个复杂的迷宫里寻找特定出口，研究者们通常需要依赖少数几种“外源”药物筛选标记（比如来自人类或真菌的耐药基因）来挑选出那些被成功改造的寄生虫。这不仅限制了研究者对同一个寄生虫进行多次、连续的基因改造，还可能因为外源标记的残留而影响后续实验。
为了解决这个“工具箱”局限性的问题，瑞士伯尔尼大学的研究团队（E. C. 等人）独辟蹊径，从疟原虫自身入手，开发了一种名为 CRISPR/Cas9pyrR的全新基因编辑策略。他们的核心思路是“借力打力”：利用疟原虫自身已经进化出的药物抗性机制。恶性疟原虫能对抗疟疾常用药乙胺嘧啶（Pyrimethamine, PYR），通常是因为其二氢叶酸还原酶-胸苷酸合酶基因（pfdhfr-ts）发生了几个关键的点突变。于是，研究人员设计了两把“剪刀”和两个“修复模板”，分别放在两个不同的质粒上。第一个质粒是常规的“基因编辑工具箱”，包含了 Cas9 剪刀、靶向研究者感兴趣的目的基因的向导 RNA（sgRNA），以及用于精确修复和标记该基因的 DNA 模板。第二个质粒则是此次研究的“精髓”，它携带了靶向疟原虫自身pfdhfr-ts基因的 sgRNA，以及一个包含四个能赋予高浓度 PYR 抗性点突变的“修复模板”。当这两个质粒被一同转入疟原虫后，只有那些同时接收了二者的“幸运儿”，才能一方面完成对目的基因的编辑，另一方面将自己的pfdhfr-ts基因改造成抗药版本。在后续施加的 PYR 药物压力下，只有这些“双料改造”的寄生虫能够存活下来，而那些只拿到一个质粒的则会被清除。这种方法巧妙地绕过了对外源筛选标记的依赖，相当于给后续的迭代基因编辑“腾出了位置”。这项创新性的研究成果发表在了《mSphere》期刊上。
为了完成这项研究，作者主要运用了以下几项关键技术：1. 分子克隆与质粒构建，包括吉布森组装（Gibson assembly）和 T4 DNA 连接酶反应，构建了包含 CRISPR/Cas9 系统组件和同源修复模板的特定质粒。2. 恶性疟原虫 NF54 株的转染与筛选，通过电穿孔法将质粒共转染入寄生虫，并使用乙胺嘧啶（PYR）或 WR99210 等药物进行选择性压力培养。3. 遗传修饰验证技术，包括对寄生虫基因组 DNA 进行 PCR 鉴定和桑格测序，以确认目的基因和内源性pfdhfr-ts基因的成功编辑。4. 活细胞荧光显微成像，使用 Hoechst 33342 染色细胞核，在配备特定滤光片的显微镜下观察 GFP 或 mScarlet 等荧光蛋白标记的靶蛋白在寄生虫无性期和配子体发育各阶段的定位与表达动态。5. 高内涵显微镜与图像分析，用于自动定量分析大量单个寄生虫细胞中多个荧光信号（如 PfAP2-G-HAmSc 和 PfNUP116-GFPDD）的共表达情况。
研究结果
CRISPR/Cas9pyrR方法的无痕基因编辑设计
研究人员设计的 CRISPR/Cas9pyrR系统依赖于两个质粒的共转染。质粒1负责编辑目的基因，质粒2则负责向内源性pfdhfr-ts基因引入四个赋予乙胺嘧啶高抗性的点突变（N51I, C59R, S108N, I164L）。理论模型表明，在 PYR 选择压力下，只有同时获得两个质粒并成功编辑了两个基因座的寄生虫才能存活和增殖。
应用 CRISPR/Cas9pyrR方法对 PfGEX1 进行 C 端标记
作为概念验证，研究人员首先利用 CRISPR/Cas9pyrR在 NF54 寄生虫株中构建了表达 GFP 标记的假定核膜相关蛋白 PfGEX1 的转基因株系。活细胞荧光显微镜观察发现，PfGEX1-GFP 在无性血液期寄生虫中不表达。但在配子体发育过程中，从第6天（III期）开始，GFP 信号在细胞核周围显现，并在第8-9天（IV/V期）达到高峰，明确标记了晚期配子体的核膜，揭示了核形态在性分化过程中的复杂变化。
应用 CRISPR/Cas9pyrR方法对 PfNUP116 进行 C 端标记
接着，研究团队用同样的方法标记了另一个假定核孔蛋白 PfNUP116，并融合了 FKBP 去稳定化结构域（DD）。初步观察发现，与之前基于抗体的研究报告相反，PfNUP116-GFPDD 在绝大多数无性期寄生虫中不表达，仅在一小部分单核细胞中可检测到核周点状信号，提示其可能具有阶段特异性表达模式。
PfNUP116 不在无性期寄生虫中表达，而特异性在性化环状体阶段诱导表达
为了明确验证 PfNUP116 的表达模式，研究人员在已构建的 NF54/NUP116-GFPDD 寄生虫中，又利用人源dhfr（hdhfr99%不表达）。这一结果确凿地证明 PfNUP116 特异性在性化寄生虫中表达，而不在无性期表达。
PfNUP116 在配子体发育过程中的定位动态
为了更详细地研究 PfNUP116 的定位，研究人员在 NF54/NUP116-GFPDD 寄生虫中第三次使用了基因编辑，标记了在无性期和配子体期均表达的核孔蛋白 PfNUP313。活细胞成像显示，在无性期，只有 PfNUP313-mSc 表达，而 PfNUP116-GFPDD 无法检测到。在晚期性化环状体中，两者在一个核周位点共定位。在配子体发育早期（I期），PfNUP116 仍局限于该位点，而 PfNUP313 开始沿核膜扩散。在 II-III 期配子体中，经常观察到第二个 PfNUP116 核周点。随着配子体进一步成熟，PfNUP116 信号逐渐减弱、分散，在成熟的 V 期配子体中几乎检测不到。这些结果表明 PfNUP116 是早期配子体特异的核周标记物，其定位动态变化提示了核周区成分在有性分化过程中的动态重组。
研究结论与讨论
本研究成功开发并验证了 CRISPR/Cas9pyrR这一新型基因编辑策略。该方法的核心优势在于，通过将乙胺嘧啶抗性突变引入疟原虫内源的pfdhfr-ts基因，实现了不依赖任何外源药物筛选标记的转基因寄生虫筛选。这有效地解决了当前恶性疟原虫基因编辑工具箱中外源筛选标记数量有限、制约迭代遗传操作的瓶颈问题。研究人员证实，经 CRISPR/Cas9pyrR改造的、对 PYR 抗性的寄生虫，仍然对另一种抗叶酸药物 WR99210 敏感，因此可以无缝衔接使用基于 hdhfr/WR99210 系统的后续轮次基因编辑，实现了真正的连续遗传工程。
作为该方法的应用实例，研究成功构建了分别表达 PfGEX1-GFP 和 PfNUP116-GFPDD 的转基因株系，并对这两个假定核周蛋白进行了深入的功能性定位研究。研究得出以下重要生物学结论：1. PfGEX1 是恶性疟原虫晚期配子体核膜的特异性标记蛋白，其在无性期不表达，从配子体 III 期开始定位于核膜。这与其在伯氏疟原虫中的同源蛋白功能一致，提示其在疟疾传播中可能扮演关键角色。2. 更为重要的是，研究修正了之前的认知，明确证明核孔蛋白 PfNUP116 并非在所有无性血液期表达，而是特异性在性化环状体阶段被诱导表达，是早期配子体的标志物。它在配子体发育早期呈现动态的、与 PfNUP313 不同的核周定位模式，可能代表着一种非典型的核孔相关结构，其动态变化暗示了核周区组成在性分化过程中发生显著重塑。
总之，CRISPR/Cas9pyrR不仅为恶性疟原虫研究提供了一个强大、灵活且与现有方法互补的新型遗传学工具，尤其适用于需要多次基因编辑的研究，而且其应用本身也产生了新的生物学见解，发现了 PfGEX1 和 PfNUP116 这两个分别标记晚期和早期配子体的新核标志物，为深入理解疟原虫有性分化的细胞生物学基础开辟了新道路。该策略的设计理念（利用内源性抗药等位基因）也具有启发性，或可推广至利用其他内源性抗性机制，从而进一步丰富疟原虫乃至其他病原体的基因编辑工具箱。
