对糖缀疫苗的免疫反应取决于多糖长度与糖基化密度之间的平衡

《Carbohydrate Polymers》：Immune responses to glycoconjugate vaccines rely on a balance between polysaccharide length and glycosylation density

糖基化疫苗设计中单位点连接策略下多糖链长度与免疫原性平衡的研究。测试了脑膜炎球菌A/C和肺炎球菌8/14多糖不同长度的单点及随机连接，发现短链（15-20单元）单点连接即可引发高效抗多糖免疫，而低免疫原性A型多糖需更长的链。随机连接虽增加糖密度但削弱蛋白免疫原性，强调需根据多糖类型优化链长与密度比。

　　

Filippo Carboni | Nicoletta Bechi | Daniela Proietti | Cristiana Balocchi | Daniele Casini | Barbara Brogioni | Enrico Luzzi | Marta Tontini | Elena Cartocci | Brunella Brunelli | Sabine Reyter | Immaculada Margarit | Maria Rosaria Romano | Roberto Adamo

GSK，Via Fiorentina 1，53100，锡耶纳，意大利

摘要

糖缀合疫苗对细菌感染具有疗效。实现最佳免疫原性的关键特征是碳水化合物与蛋白质的比例以及由此产生的糖基化密度。当蛋白质同时充当载体和抗原时，将糖基化定向到特定位置是有益的，但这种方法的缺点是连接的糖链数量有限，可能会降低抗糖基化的免疫反应。

我们研究了多糖长度是否对单位点选择性糖缀合物的免疫原性优化至关重要。我们测试了脑膜炎球菌A型和C型以及肺炎球菌8型和14型的多糖。使用脑膜炎球菌fHbp蛋白作为载体。通过硫醇-马来酰亚胺加法在C端半胱氨酸处进行位点选择性糖基化，而随机糖基化则是通过经典的赖氨酸偶联方法实现的。结果表明，对于脑膜炎球菌C型和肺炎球菌8型及14型，即使仅在一个位点连接，长度超过15-20个重复单元的低聚糖也能引发强烈的抗糖基化反应。相比之下，免疫原性较低的脑膜炎球菌A型则需要更长的糖链才能产生强烈反应。此外，随机糖基化虽然增加了糖基化的程度，却降低了蛋白质的免疫原性。这些发现强调了在糖链长度和密度之间找到最佳平衡对于有效设计糖缀合疫苗的重要性。

引言

几十年来，糖缀合疫苗在预防传染病方面发挥了重要作用，现在已有针对b型流感嗜血杆菌（Hib）（Schneerson等人，1980年）、肺炎链球菌（23个血清型）（Geno等人，2015年）、脑膜炎奈瑟菌（A、C、W和Y型）（Pace & Pollard，2007年）以及最近的伤寒沙门氏菌（Acharya等人，1987年；Klugman等人，1987年；Tacket等人，1988年）的有效且成本效益高的疫苗。将细菌多糖与载体蛋白共价连接至关重要，这可以将原本无法诱导高亲和力或持久抗体、也无法在两岁以下儿童中触发免疫记忆的未缀合多糖（本质上是T细胞非依赖性抗原）转化为T细胞依赖性抗原，从而能够在婴儿中诱导持久的、可增强的抗糖基化免疫反应（Pace，2013年）。此外，糖缀合疫苗在减少细菌携带和传播方面也取得了显著效果（Ramsay等人，2003年；Rodgers等人，2021年）。随着全球血清型分布的变化和血清型的替代，疫苗覆盖率需要持续提高，同时也增加了疫苗的复杂性（Geno等人，2015年；Herva等人，1980年；Ji等人，2017年）。例如，最近批准了PCV20（20价肺炎球菌结合疫苗）以扩大之前的13价疫苗的覆盖范围（Klein等人，2021年），并且正在研发更高价次的疫苗（Micoli等人，2023年）。新型结合疫苗也在临床试验中针对多种耐药病原体进行测试，如弗莱克斯纳志贺菌、肺炎克雷伯菌和大肠杆菌（Huttner & Gambillara，2018年；Micoli等人，2021年；Talaat等人，2021年）。一些耐药细菌复杂的逃逸机制要求采用复杂的疫苗配方来预防感染（Cheung等人，2021年）。因此，人们正在积极探索更广泛、更复杂的疫苗设计策略。

传统的糖缀合疫苗是由细菌来源的多糖制成的，这些多糖可以是完整的，也可以通过酸或氧化裂解来调整大小，然后以随机方式与载体蛋白中的暴露氨基酸残基（如赖氨酸或天冬氨酸）进行化学结合（Costantino等人，2011年；Khatun等人，2017年；Ravenscroft等人，2015年）。这类组装的糖缀合疫苗的免疫原性受多种相互依赖的参数影响，包括糖链的类型（带电或不带电）及其可能的修饰（例如乙酰化）、糖链长度、连接的糖链数量、载体蛋白的类型、结合化学方法以及所使用的连接剂（Adamo，2017年）。

迫切需要简化疫苗组成的技术，这推动了对能够实现这一目标的技术的兴趣。位点选择性糖基化方法因其能够控制糖基化方向、提供具有更明确糖链长度的生物分子，并允许使用与病原体相关的蛋白质作为载体而受到关注（Adamo，2021年；Adamo等人，2013年；Sorieul等人，2025年）。使用新型细菌蛋白作为载体还有助于防止载体表位抑制现象，这种现象由于目前可用载体的数量有限而导致对糖缀合疫苗的免疫反应减弱（Micoli等人，2018年）。

位点选择性方法包括对氨基酸残基（特别是半胱氨酸（Bernardes等人，2006年；Carboni等人，2022年；Grayson等人，2011年；Stefanetti等人，2015年）和酪氨酸（Q.-Y. Hu等人，2013年；Nilo等人，2014年；Nilo等人，2015年）的化学修饰、酶催化的糖基化（Garufi等人，2012年；Wu等人，2010年）、非天然氨基酸的引入（Kapoor等人，2018年；Kapoor等人，2022年）以及用于表达异源糖链的糖工程（Kay等人，2019年）。

很少有研究全面详细探讨了糖基化密度（即连接的糖链数量）对结合疫苗免疫原性的影响（Pozsgay等人，1999年；van der Put等人，2016年）。由于使用了随机糖基化方法，这些研究难以建立精确的结构-免疫原性关联，因为这些方法无法考虑糖基化位点的固有变异性。与随机糖基化不同，位点选择性方法提供了更准确地将免疫原性与关键糖缀合特征（如糖基化位点和相关糖链长度）相关联的机会（Stefanetti等人，2015年）。然而，当前位点选择性技术的一个局限性是它们只能在蛋白质上引入有限数量的糖基团，这可能导致次优的抗碳水化合物免疫反应（Adamo等人，2014年；Romano等人，2022年）。

我们假设，当使用选择性单位点糖基化方法比随机方法更有效地保留蛋白质表位时，多糖长度可能对优化免疫原性至关重要。

为了解决这个问题，我们详细评估了碳水化合物的长度和连接的糖链数量如何影响通过选择性偶联到单个半胱氨酸残基（确保糖基化方向）或通过随机偶联到多个赖氨酸残基（通常用于许可疫苗中的方法）获得的糖缀合物的免疫原性（Micoli等人，2023年）。为此，我们选择了A型和C型脑膜炎球菌多糖（这些多糖是注册的ACWY结合疫苗的成分（Berti等人，2021年）以及8型和14型肺炎球菌多糖（这些多糖是商业PCV20的组成部分（图1）（Micoli等人，2023年）。值得注意的是，在12种脑膜炎球菌血清型中，ABCWY导致了大多数病例（https://www.cdc.gov/vaccines/pubs/surv-manual/chpt08-mening.html）。虽然已有针对ACWY血清型的四价结合疫苗，但由于脑膜炎球菌C型荚膜多糖与神经碳水化合物的结构相似性，B型脑膜炎球菌主要通过基于蛋白质的疫苗进行预防（Finne等人，1983年）。作为模型蛋白，我们使用了与病原体相关的fHbp蛋白，这是两种市售B型脑膜炎球菌疫苗Bexsero和Trumemba的关键成分（Masignani等人，2019年；McNeil等人，2013年）。研究结果提供了关于平衡糖链长度和糖基化密度（由糖链数量决定）对于多价疫苗中多糖和蛋白质成分的最佳免疫原性必要性的重要见解。

章节片段

糖源

天然多糖来自GSK的生产工厂。MenA、MenC、Pn8和Pn14寡糖是根据先前的方法从细菌提取的多糖制备的（Costantino等人，1999年；Morais等人，2018年）。

糖谱分析

生成的寡糖通过HPAEC-PAD分析进行了分析。MenA和MenC样品用0.2 M NaOH处理并在37°C下孵育2小时以去除-O-乙酰基，从而简化糖谱。HPAEC-PAD分析使用Dionex仪器进行。

糖缀合物的制备

为了在精确的位置修饰蛋白质抗原并避免对相关蛋白质表位产生潜在影响，我们表达了融合蛋白fHbp231（以下简称fHbp），该蛋白包含共生奈瑟菌菌株中最常见的三种基因变异（Masignani等人，2003年），并在其C端添加了一个半胱氨酸以便后续与马来酰亚胺修饰的糖链结合（补充信息S1）。该融合蛋白不包含任何Cys残基。

讨论

糖基化将多糖转化为T细胞依赖性抗原，增强了免疫原性，产生了记忆效应，并为婴儿提供了强而持久的保护（Avci等人，2013年）。目前许可的糖缀合疫苗基于随机糖基化方法，这种方法可能对抗蛋白质载体的免疫反应有害。随着新疫苗配方的出现，能够更好地保留载体抗原表位的方法变得越来越重要。

结论

这项研究揭示了在单点位点进行糖基化修饰时糖链长度的影响。我们的数据表明，对于长度在15-20个重复单元范围内的短糖链，将其结合到一个位点可以引发强烈的抗糖基化反应，同时保护蛋白质载体的功能表位。然而，对于免疫原性较低的糖链，则需要更长的糖链进行糖基化。

术语表

ABCWY
脑膜炎球菌A、B、C、W、Y血清型
ACWY
脑膜炎球菌A、C、W、Y血清型
ADH
己二酸二肼
avDP
平均聚合度
CD1 (ICR)
分化簇1（癌症研究所）小鼠品系
CRM₁₉₇
交叉反应物质197
DT
白喉类毒素
ELISA
酶联免疫吸附测定
fHbp
融合蛋白fHbp231
Gal
半乳糖
GBS
B群链球菌
Glc
葡萄糖
GlcA
葡萄糖醛酸
GlcNAc
N-乙酰葡萄糖胺
GMT
几何平均滴度
HCl
盐酸
Hib
流感嗜血杆菌

CRediT作者贡献声明

Filippo Carboni：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，研究，数据管理。Nicoletta Bechi：撰写 – 审稿与编辑，方法学。Daniela Proietti：撰写 – 审稿与编辑，数据管理。Cristiana Balocchi：撰写 – 审稿与编辑，数据管理。Daniele Casini：撰写 – 审稿与编辑，数据管理。Barbara Brogioni：撰写 – 审稿与编辑，方法学，数据管理。Enrico Luzzi：方法学，形式分析，数据管理。Marta Tontini：撰写 –

利益冲突声明

所有作者均为GSK集团的员工。RA、MRR和IM持有公司股票期权。Bexero和Trumemba是注册商标。

致谢

作者感谢Paolo Costantino在本案工作中的科学建议。作者还要感谢GSK动物资源中心的卓越支持。