在脂肪绿鱼（Hexagrammos otakii）中，对12种Toll样受体的全基因组特征分析、分子进化研究及其在感染哈维弧菌（Vibrio harveyi）后的反应

《Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics》：Genome-wide characterization, molecular evolution of twelve toll-like receptors in fat greenling ( Hexagrammos otakii) and their response following Vibrio harveyi infection

黄尾鲈TLR基因家族的系统鉴定与功能分析显示，该物种拥有12个TLR基因，分为TLR1、3、5、7、11亚家族，具有典型LRR、跨膜和TIR结构域，呈簇状染色体分布。进化分析表明其与近缘 Perciform鱼类亲缘关系最近。组织特异性表达及Vibrio harveyi感染后关键基因（如TLR1、TLR5m）显著上调，证实其在细菌免疫中的核心作用，为冷水鱼病害防控提供理论支撑。

　　

张英雪|张亚明|向江南|魏旭雅|张彤|何婷婷|张云诺|李学杰|王伟

中国辽宁省大连海洋大学北方鱼类应用生物学与水产养殖重点实验室，大连，116023

摘要

作为先天免疫系统的关键组成部分，Toll样受体（TLRs）的主要功能是检测和识别病原体。在硬骨鱼类中，TLRs表现出相当的复杂性和多样性，在提供强大而灵活的第一道免疫防线中发挥着至关重要的作用。然而，其在Hexagrammos otakii中的基因组结构和分子进化仍知之甚少。在本研究中，我们鉴定了H. otakii中的十二个TLR基因，并将其分为五个亚家族（TLR1、TLR3、TLR5、TLR7、TLR11）。这些基因具有保守的蛋白质结构，包含典型的细胞外亮氨酸富集重复（LRR）结构域、跨膜（TM）结构域和细胞内Toll/IL-1受体（TIR）结构域，并且它们在染色体上呈簇状分布。系统发育重建表明，HoTLRs与另一种鲈形目鱼类Anarrhichthys ocellatus的相应基因具有最接近的进化关系。组织表达分析显示，所有HoTLR基因在体内具有广泛但独特的表达模式。此外，使用细菌病原体Vibrio harveyi进行的实验诱导了包括TLR1和TLR5m在内的关键基因的显著、时空特异性的上调，突显了它们在H. otakii中协调抗菌先天免疫防御中的活跃作用。本研究为硬骨鱼类中TLR家族的进化模式提供了新的见解，并为H. otakii的水产养殖中的疾病预防和控制策略奠定了分子理论基础。

引言

先天免疫，也称为非特异性免疫，是保护身体免受入侵病原体侵害的机制（Secombes等人，2001年）。它通过与模式识别受体（PRRs）协同工作，快速触发非特异性免疫反应，这些受体能够检测到病原体上高度保守的病原体相关分子模式（PAMPs），从而执行免疫防御功能（Kawai和Akira，2010年；Carlson等人，2023年）。Toll样受体（TLRs）是一类重要的PRRs，因其与Drosophila中的Toll蛋白具有高度结构相似性而得名（Medzhitov等人，1997年）。它们能够识别PAMPs中的保守区域，如脂多糖（LPS）、脂蛋白、鞭毛蛋白和双链RNA（dsRNA）。不同的TLRs具有独特的配体特异性和信号通路（Takeda等人，2003年）。

研究表明，哺乳动物中的TLR家族包含十三个成员，而人类和小鼠分别表达十个和十二个TLR基因（Moresco等人，2011年）。硬骨鱼类拥有更为多样化的TLR谱系，包括超过二十一种TLR类型（Palti，2011年）。硬骨鱼类保留了哺乳动物TLR的同源物，如TLR1–5和TLR7–9，尽管它们缺乏TLR6和TLR10，并且还发展出了许多鱼类特有的TLR，包括TLR18–23和TLR25–28（Kanwal等人，2014年）。与哺乳动物相比，硬骨鱼类的TLR家族表现出更大的复杂性和独特性。这种差异主要归因于硬骨鱼类祖先发生的全基因组复制（WGD）事件，这促进了基因家族的广泛扩展和功能多样化。因此，硬骨鱼类拥有比哺乳动物更大且功能更丰富的TLR集合（Aoki等人，2008年；Alexandrou等人，2013年；Glasauer和Neuhauss，2014年）。

系统发育分析将脊椎动物的TLRs分为六个主要亚家族：TLR1、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7和TLR11。其中，TLR1亚家族包括TLR1、TLR2、TLR6、TLR10、TLR14、TLR18、TLR25和TLR28（Roach等人，2005年；Gong等人，2017年；Wang等人，2025年），主要负责识别微生物脂蛋白成分。在哺乳动物中，TLR2可以与TLR1异二聚化，共同检测三酰基化脂蛋白（Huang等人，2011年）。TLR3亚家族仅由TLR3基因代表，它负责检测病毒感染过程中产生的dsRNA（Alexopoulou等人，2001年）。TLR4亚家族也仅包含TLR4基因；在哺乳动物中，TLR4识别LPS。相比之下，在鱼类中，TLR4不结合LPS，而是作为NF-κB信号通路的负调节因子（Meseguer等人，2009年）。在高等脊椎动物中，TLR5亚家族包含一个成员TLR5，它检测细菌鞭毛蛋白。然而，在硬骨鱼类中，这个亚家族分化为膜结合形式（TLR5M）和可溶形式（TLR5S）。TLR5M负责检测鞭毛蛋白（Tsujita等人，2004年；Guo等人，2024年），而TLR5S在液相中识别鞭毛蛋白，并与TLR5M协同增强下游信号传导（Hwang等人，2010年）。TLR7亚家族包括TLR7–9。TLR7和TLR8介导病毒ssRNA的识别（Heil等人，2004年），而TLR9检测含有未甲基化CpG基序的细菌或病毒DNA（CpG-DNA）（Hemmi等人，2000年）。TLR11亚家族的成员表现出显著的物种特异性变异。虽然小鼠中存在TLR11、TLR12和TLR13，但人类缺乏TLR11亚家族的功能基因。在硬骨鱼类中，这个亚家族包括TLR13、TLR19、TLR20、TLR21、TLR22和TLR27（Liu等人，2020年）。在Mus musculus中，TLR11和TLR12识别Toxoplasma gondii的prolamin（Koblansky等人，2013年），并且TLR13已被证明可以识别细菌23S rRNA（Gao等人，2021年）。在鱼类特有的TLRs中，TLR19识别dsRNA（Ji等人，2018年），TLR20应对寄生虫感染（Pietretti等人，2014年），TLR21特异性识别CpG-DNA，而TLR22识别长dsRNA分子（Matsuo等人，2008年）。

TLRs是一类保守的I型跨膜糖蛋白，具有典型的模块化结构，主要由三个核心结构域组成：细胞外亮氨酸富集重复（LRR）结构域、跨膜（TM）结构域和细胞内Toll/白细胞介素-1受体（TIR）结构域（Kawai和Akira，2010年）。LRR结构域介导配体的特异性识别，而TIR结构域有助于招募下游适配器蛋白，这些适配器蛋白也包含TIR结构域，包括髓样分化初级响应88（MyD88）、含有TIR结构域的干扰素-β诱导适配器（TRIF）和TRIF相关适配器分子（TRAM）（Rebl等人，2010年；Fekonja等人，2012年）。TLRs与这些适配器蛋白的结合启动了细胞内信号级联反应，最终导致关键转录因子（如核因子-κB（NF-κB）和干扰素调节因子（IRFs）的核转位。这些转录因子的激活促进了免疫效应分子的转录上调，尤其是促炎细胞因子和I型干扰素，从而有助于宿主对抗病原体挑战（Asami和Shimizu，2021年）。

Hexagrammos otakii属于鲉形目（Scorpaeniformes）、Hexagrammidae科和Hexagrammos属，是一种适应寒冷环境的具有经济价值的底栖鱼类。由于其嫩肉和细腻的风味，在消费市场上非常受欢迎（Habib等人，2011年）。然而，该物种容易受到各种病原体感染，包括细菌、真菌和病毒性疾病。特别是由Vibrio harveyi引起的感染在养殖业中很常见，常常导致巨大的经济损失，从而阻碍了其商业化养殖的扩展（Diao等人，2019年）。因此，迫切需要阐明H. otakii的免疫反应机制。作为先天免疫的关键组成部分，TLRs在该物种中的家族组成和功能作用尚未得到充分研究。本研究深入探讨了H. otakii中的TLR基因家族，鉴定出十二个不同的TLR成员。此外，我们还研究了它们的保守结构域、基因结构、系统发育关系、组织特异性表达模式以及对细菌刺激的反应。这些结果为进一步理解硬骨鱼类中TLR的进化过程和功能作用奠定了基础。

实验部分

实验鱼类

H. otakii样本来自辽宁省大连市沙河口区的新兴市场，平均体重为25±5克。在正式实验开始之前，共有60条鱼在大连海洋大学农业部的北方水产养殖基地进行了为期两周的适应训练。鱼被饲养在200升的充气水箱中，水温控制在15±3°C，pH值保持稳定

HoTLR基因的鉴定与分析

在H. otakii中筛选并鉴定了十二个TLR基因，分别命名为HoTLR1、HoTLR2a、HoTLR2b、HoTLR3、HoTLR5s、HoTLR5m、HoTLR7、HoTLR8、HoTLR9、HoTLR13、HoTLR18和HoTLR21。这些基因的序列已提交至NCBI，登录号为PX979765、PX979766、PX979767、PX979768、PX979769、PX979770、PX979771、PX979772、PX979773、PX979774、PX979775和PX979776。随后，系统地分析了这些TLR蛋白的基本理化性质（

讨论

Toll样受体作为高度保守的PRRs，在硬骨鱼类和其他脊椎动物的先天免疫系统中发挥着关键作用（Blasius和Beutler，2010年；Nie等人，2018年）。在这项研究中，我们首次系统地鉴定了H. otakii中的TLR基因家族，共发现了十二个不同的成员。我们进行了全面的分析，包括它们的序列特征、系统发育关系、组织特异性表达模式等

结论

在H. otakii中，系统地鉴定了十二个TLR基因（TLR1、TLR2a、TLR2b、TLR3、TLR5s、TLR5m、TLR7、TLR8、TLR9、TLR13、TLR18和TLR21）。通过对它们的基因组结构、系统发育关系以及V. harveyi感染后的组织特异性表达模式的全面分析，表明这些TLR基因在不同组织中广泛但选择性地表达。此外，在免疫反应过程中，它们表现出不同的调控模式

CRediT作者贡献声明

张英雪：撰写 – 审稿与编辑、可视化、验证、方法学、研究、数据管理。张亚明：数据管理。向江南：可视化、验证。魏旭雅：可视化、软件操作。张彤：可视化、验证。何婷婷：研究。张云诺：方法学。李学杰：撰写 – 审稿与编辑、方法学、概念构思。王伟：撰写 – 审稿与编辑、资金获取、概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。