新一代质谱技术为蛋白质组学带来什么？一项综合性平台比较

《Journal of Proteome Research》：What Does Next-Generation Mass Spectrometry Offer for Proteomics? A Comprehensive Platform Comparison

　　

下一代质谱平台（Orbitrap Astral、timsTOF Ultra）通过增强分析深度和灵敏度正在重塑蛋白质组学。研究人员利用支气管肺发育不良（BPD）模型的新生小鼠肺组织（n = 12），比较了这些平台与Orbitrap Exploris 480的性能，采用了四种采集策略：Exploris 480 DDA/DIA、Astral HR-DIA和timsTOF Ultra DIA-PASEF。所有平台共同鉴定了约4000种蛋白质，数据非依赖采集（DIA）方法对数据依赖采集（DDA）鉴定的蛋白质组覆盖率达98%，且下一代系统间的一致性为92%。Orbitrap Astral和timsTOF Ultra分别定量了超过225,000个肽段和13,000种蛋白质，其深度分别是Exploris 480 DDA的约800%和约300%。此外，新一代平台将推荐样本量减少了约66%。增强的蛋白质组深度将亚细胞区室注释从30%（DDA）提升至66%（下一代平台），并将Reactome通路覆盖从58%（DDA）提升至90%（下一代平台）。差异表达分析显示，DIA数据集鉴定出的表型相关蛋白数量是DDA的四倍，这些蛋白富集于线粒体、核糖体和细胞外组分，并涉及多达44条富集通路。重要的是，独特检测到的蛋白质未显示出功能注释偏差。这些发现表明，在多供应商的新一代平台上进行DIA采集可提供卓越的蛋白质组覆盖度，并能更完整地评估系统生物学而不引入偏差，从而增强了对复杂生物系统的理解。

该研究针对下一代质谱技术在蛋白质组学中的应用进行了深入剖析。研究背景源于自下而上蛋白质组学（bottom-up proteomics）作为表征蛋白质组的金标准，其数据采集策略主要分为数据依赖采集（DDA）和数据非依赖采集（DIA）。尽管DDA自2000年代初以来一直是金标准，但DIA凭借质谱仪器和生物信息学工具的进步逐渐成为主流。然而，随着2023年Thermo Orbitrap Astral和Bruker timsTOF Ultra等具有更高灵敏度和扫描速率的下一代质谱仪的发布，目前尚缺乏对这些新平台与旧平台在系统生物学层面影响的全面基准测试。现有研究多局限于单一新仪器与旧平台的对比，且往往忽略了蛋白质组深度增加对生物学解释的具体影响。因此，研究人员旨在通过对比Orbitrap Exploris 480（代表旧平台）与新一代平台在DDA及DIA模式下的表现，评估DIA采集如何在不引入偏差的情况下提升系统生物学评估的完整性。

为实现这一目标，研究人员采用了多项关键技术方法。样本来源于支气管肺发育不良（BPD）新生小鼠模型，包含常氧（NO）和高氧（HO）两组，每组6只（雌雄各半），并将每只样本等量分为四份用于不同平台分析。实验涵盖了四种质谱采集策略：Orbitrap Exploris 480 DDA、Orbitrap Exploris 480 DIA、Orbitrap Astral HR-DIA和timsTOF Ultra DIA-PASEF。数据处理方面，DDA数据采用PEAKS软件分析，DIA数据则统一使用Spectronaut软件的directDIA模式处理。统计分析利用limma包进行差异蛋白表达分析，并通过SubcellularRVis和EnrichR分别进行亚细胞定位和Reactome通路富集分析。此外，还使用了PowerExplorer R包进行功效分析以估算所需样本量。

研究结果部分详细展示了各项对比数据：

1. 1.
   平台设置与全局性能指标：通过对比发现，DIA采集在所有仪器上的蛋白质组覆盖率均优于DDA。Orbitrap Astral和timsTOF Ultra在定量肽段和蛋白质数量上显著优于Exploris 480 DDA，分别提升了约800%和300%。
2. 2.
   蛋白质可检测性增加对生物学覆盖的影响：随着蛋白质组深度的增加，亚细胞区室注释覆盖率从DDA的30%提升至下一代平台的66%；Reactome通路覆盖从DDA的58%提升至下一代平台的90%。这表明DIA驱动的深度增加并非特定于某一细胞区室，而是全面提升了生物学通路的探测能力。
3. 3.
   新一代仪器捕获更多生物学方差：主成分分析（PCA）显示，所有平台均能分离对照组和高氧组，但DIA模式及新一代平台（Astral和timsTOF）解释了更高的生物学方差（PC1约46%）。样本间皮尔逊相关性分析显示，两个新一代平台之间的平均相关性最高（约0.87）。
4. 4.
   统计功效：功效分析表明，要达到90%的统计功效，Orbitrap Exploris 480 DDA需要15个重复，而新一代平台仅需4-5个，这意味着样本量需求减少了约66%。
5. 5.
   跨平台差异表达蛋白的捕获：差异表达分析鉴定出的蛋白数量随覆盖率增加而上升，新一代平台鉴定出的差异蛋白数量约为DDA的四倍。这些差异蛋白主要富集于线粒体、核糖体及细胞外区域，这与BPD的发病机制相符。
6. 6.
   DIA蛋白质组深度提供生物学完整性而非独特性：通过将DIA数据集中差异蛋白映射至DDA数据集，发现约70%的差异调节蛋白在DDA中未被检测到。进一步的GO分析显示，这些新增蛋白并未带来独特的生物学功能注释，而是增强了原有生物学信息的完整性。

在讨论与结论部分，研究人员指出，数据非依赖采集结合下一代仪器改进的灵敏度和扫描速率，极大提高了肽段和蛋白质的鉴定能力。数据显示，扩展的蛋白质组提升了生物学注释的完整性，并更好地解析了生物学群体结构，同时显著降低了所需的生物学重复样本量（约66%）。尽管新一代仪器在探测蛋白质组时表现出显著的一致性，但在捕获差异表达时仍存在差异。研究的一个局限性在于使用了略有不同的色谱柱、梯度和样品量，这妨碍了纯粹液相色谱性能的比较，但这是为了探索市场上多种平台能力的权衡之举。总体而言，DDA方法能够捕捉给定模型的生物学特征，而DIA方法则极大地提高了信息的完整性。这项工作代表了蛋白质组学领域的一个时间快照，预示着该领域在离子光学、更快的数据采集速度和增强的生物信息学框架方面将持续取得进展，未来在空间蛋白质组学等领域具有广阔的应用前景。该研究最终发表于《Journal of Proteome Research》。