将基于图像的表型分析与QTL（数量性状遗传位点）映射技术相结合，以提高水稻对细菌性粒腐病的遗传抗性，并加速相关育种进程

《Theoretical and Applied Genetics》：Integrating image-based phenotyping and QTL mapping to enhance genetic resistance and accelerate breeding for bacterial grain rot resistance in rice

　　摘要
由Burkholderia glumae引起的细菌性谷物腐烂（BGR）是一种主要疾病，会降低水稻（Oryza sativa L.）的产量，从而威胁粮食安全。传统的表型分析方法在客观评估抗病性和理解遗传基础方面存在局限性。在这项研究中，我们将基于图像的表型分析与QTL作图相结合，以筛选与B. glumae抗性相关的QTL和候选基因。将B. glumae接种到189个重组自交系（RILs）中，这些自交系来源于抗性品种Kele和易感品种IS592BB，随后使用DAB染色进行可视化及定量分析。测量了包括田间抗性评分、病穗比例（%）、DAB染色强度和病斑面积比例（%）在内的表型参数，并用于QTL作图。在1号染色体上，Chr01_24592710-Chr01_37274755区间内，鉴定出四个重叠的QTL：qFRS1 [LOD: 5.98，表型变异解释（PVE）：15.41%]、qRDS1（LOD: 5.29，PVE: 18.56%）、qQDS1（LOD: 9.58，PVE: 22.02%）和qRDA1（LOD: 8.44，PVE: 31.51%）。经过精细作图后，我们将研究范围缩小到Chr01_33472174-Chr01_33838140区间，并在该区域筛选出16个候选基因。其中，OsBGq1被发现编码一个核苷酸结合的LRR受体（NLR）结构域。OsBGq1在B. glumae感染后表达显著增加。此外，属于Kele类型的RILs在B. glumae感染后表现出更高的ROS清除酶活性和植物抗性物质积累，从而增强了抗性。本文提出将基于DAB的定量表型分析与QTL作图相结合，以提供更客观的指标来识别与BGR抗性相关的基因。

引言
水稻是一种主要粮食作物，占全球热量摄入的很大比例，被认为是最重要的粮食作物之一（Bin Rahman和Zhang 2023）。然而，由于气候变化导致的温度迅速上升，病原体活性增加，使得细菌性谷物腐烂（BGR）的发生率增加（Echeverri-Rico等人2021）。由Burkholderia glumae引起的BGR是对水稻最具破坏性的疾病之一。在美国，BGR导致路易斯安那州的水稻产量减少了40%（Ham等人2011）。值得注意的是，B. glumae的最佳活性温度相对较高，范围在30至35°C之间（Tsushima 1996）。根据世界气象组织（WMO）的报告，2024年的全球平均温度比工业化前时期（1850–1900年）高出约1.54°C。这一数值超过了2023年创下的1.45°C的记录，表明每年都出现创纪录的高温，这表明全球变暖正在加速（Amnuaylojaroen 2023）。随着全球变暖的持续，BGR的发生率预计将进一步增加，因此需要采取积极措施来减轻其影响（Ham等人2011）。目前控制BGR的主要方法是通过使用oxolinic酸对种子进行化学处理（Hikichi 1993）。然而，化学控制可能导致新的抗性菌株的出现，并造成环境污染，包括水和土壤污染（Sun等人2018）。以往的研究主要集中在控制主要水稻病害和害虫的有效方法上，如细菌性叶枯病、稻瘟病和褐飞虱侵害，这些病害会导致严重的产量损失并影响谷物质量。然而，最经济有效的方法是识别与抗性相关的数量性状位点（QTL）和基因，然后通过育种计划将其引入新品种中以开发抗性品种（Chukwu等人2019）。迄今为止，尚未开发出针对BGR的有效杀菌剂。由于环境变化，近年来BGR的发生率迅速增加。BGR通过感染穗部和穗粒直接降低产量，因此迫切需要开发抗BGR的水稻品种（Mizobuchi等人2016）。由于QTL作图涉及环境和遗传因素之间的相互作用分析，结果高度依赖于表型评估，因此准确的表型评估是分析中的关键因素（Cobb等人2013）。因此，客观和精确的表型特征评估对于QTL作图至关重要（Costa等人2019）。传统的表型分析依赖于育种者或研究人员的经验进行主观判断（Cooper等人2009）。虽然这种方法基于长期积累的知识和经验，但由于其高度的可变性和主观性而受到批评，因为结果可能因育种者的专业水平和经验而异（Yin等人2003）。最近，提出了使用扫描仪或无人机快速获取高分辨率图像的方法，以提高表型评估的准确性（Araus和Cairns 2014）。图像分析可以消除可能干扰评估的外部因素，确保样本间评估的一致性，并检测肉眼难以观察到的细微表型差异（Gill等人2022）。此外，来自高分辨率成像设备的数据可以使用计算机算法进行分析，实现定量和客观的评估。与传统的主观评估相比，这种方法具有更高的可重复性和可靠性（Xiao等人2022）。3,3'-二氨基联苯胺（DAB）染色法是一种用于检测过氧化氢（H?O?）积累的组织化学技术。它被广泛用于精确可视化植物对环境压力的反应（?nyrychová等人2009）。值得注意的是，它能够有效评估肉眼难以区分的压力反应，使其成为准确表型分析的可靠工具（Bach-Pages和Preston 2017）。

材料与方法
植物材料及田间设计
F8 KIRILs由189个品系组成，来源于抗性品种Kele（籼稻）和易感品种IS592BB（粳稻）的F1杂交。该世代在韩国国家作物科学研究所（NICS）的田间进行培育（36°6′41.54″ N, 128°38′26.17″ E）。Kele和IS592BB来自农村发展管理局（RDA）的作物育种部门。Kele是一种具有强抗BGR能力的代表性水稻品种，而IS592BB是一种易感品种（图1）。因此，选择Kele和IS592BB来构建与BGR抗性相关的QTL作图群体。KIRIL F8群体用于QTL作图和候选基因的鉴定。

图1
KIRIL对B. glumae抗性的表型分析直方图表示方法。A. 将B. glumae接种到KIRILs中，并构建了抗性评分、病穗比例、DAB染色强度和病斑面积比例的直方图。B. 根据调查参数，Kele比IS592BB具有更强的抗性。抗性评分和DAB染色强度的直方图呈正态分布，而基于DAB染色的病斑面积呈双峰分布，病穗比例呈右偏分布。Kele对B. glumae具有抗性，而IS592BB是易感品种。然而，在B. glumae感染后，Kele的黑色稻壳颜色使得视觉上难以区分病害症状。尽管IS592BB的稻壳颜色为棕色，但区分病害症状仍然具有挑战性。然而，DAB染色比基于田间的抗性评估更准确，因为抗性区域会脱色，而病斑区域则呈现为棕色斑点。使用ImageJ软件分析病斑面积。为了清晰区分病斑区域，将穗部图像转换为灰度，并测量了总穗部面积（用红色标记）。在总穗部面积内，病斑区域用黑色突出显示。为了研究病害严重程度，测量了穗部不同区域的像素值。DAB染色强烈的区域像素值较低，而未染色的白色区域像素值较高。

为了将作图群体移植到NICS田间，每个品系的种子都用Kiman Plus农药（25% Prochloraz，HANKOOKSAMGONG，首尔，韩国）处理，并在33°C下黑暗环境中培养三天。播种日期为2023年5月2日和2024年5月4日。30天后，将幼苗移植到NICS田间。每株植物的种植面积为30×15厘米，每个品系的植物种植两排，每排25株。在田间，施用了N–P2O5–K2O肥料，施用量为每10公顷9–4.5–5.7公斤。在本研究中，植物栽培和育种按照韩国RDA提供的标准方法进行，并严格遵守国际法规和指南。此外，为了确保栽培符合当地实践，还遵循了《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）[https://www.cites.org/（2023年4月21日访问）]的指南。本研究中使用的所有品种，包括Kele和IS592BB，均由韩国国家作物科学研究所（NICS，RDA）的作物育种部门提供。Hitomebore、Satojiman和Akitakomachi由韩国国家农业科学研究所（RDA）的国家农业生物多样性中心提供。

B. glumae菌株的选择及接种浓度的优化
对于B. glumae的接种，根据每个品系的抽穗日期对其进行分类，并相应地移植到田间。最早的抽穗日期为8月15日，最晚的抽穗日期为9月13日。在此期间进行了15次单独的接种。每个接种日期都对Kele和IS592BB进行了接种，以便根据接种时间比较抗性。在本研究中，穗部在NICS田间抽穗后三天通过直接喷洒进行接种。接种后五天评估抗性。用于诱导BGR的B. glumae菌株为GR20004（KACC 22751），这是一种具有稳定毒力的菌株。GR20004从韩国国家作物科学研究所（NICS，RDA）的作物基金会部门获得。获得的GR20004菌株在LB培养基中以28°C和150 RPM的速度振荡培养两天。接种当天，将GR20004培养物调整至0.5（10? cfu/ml）的浓度，并用2毫升悬浮液喷洒每个品系的穗部。

疾病抗性评估的成像数据收集
接种后五天评估病害症状。采用0-10的评分标准：如果小穗均未感染，则得分为0（0%）；如果所有小穗均感染，则得分为10（100%）。为了评估B. glumae在灌浆阶段的影响，在接种后30天评估了谷粒的不育率。每个小穗都被单独压榨以确定其胚珠是否已充满。压榨后发现完全为空的小穗被归类为不育。最终，小穗的生育力计算为充满的小穗数量占每个穗总数量的比例。为了分析图像中的病斑面积，使用EPSON GT-X扫描仪以900 dpi的分辨率扫描接种后的穗。使用可区分的颜色对每个穗的病斑区域和正常区域进行标定。测量病斑区域和正常区域的像素数以分析相对病害严重程度。相对病害严重程度通过将病斑区域的像素数除以总像素数并乘以100来计算。

**构建遗传图谱和QTL定位**
使用2,565个SNP标记对亲本系Kele和IS592BB进行了多态性分析，其中726个为多态性标记。在去除20%的缺失数据和65个重复SNP后，选择了516个有信息量的SNP用于构建图谱。遗传图谱使用IciMapping v4.0（Meng等人，2015年）和MapChart v2.0（Voorrips，2002年）开发，遗传距离基于Kosambi映射函数计算。选定的SNP均匀分布在所有12条水稻染色体上。QTL分析使用田间抗性评分、病穗比例（%）、DAB染色量以及病斑面积比例的表型数据进行。SNP聚类和遗传距离计算使用ICIM程序中的“By LOD”和“By Input”功能进行。LOD阈值设定为3.0，通过1000次置换在p<0.05的显著性水平下确定。识别的QTL按照McCouch等人（2016年）提出的命名系统命名。

**DNA提取和PCR**
为了提取基因组DNA，使用组织裂解器（Qiagen，型号85,300，德国Hilden）将植物样本研磨成粉末，并在液氮中快速冷冻。然后按照BioSprint 96 DNA Plant Kit（INDICAL BIOSCIENCE，型号SP947057；德国莱比锡）的制造商说明进行提取。使用NanoDrop ND-1000分光光度计（Thermo Fisher，型号ND 1000，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）测定提取的基因组DNA浓度，并用ddH?O稀释至最终浓度20 ng/μL。用于扩增稀释DNA中目标区域的PCR混合物包括100 ng的DNA模板、各10 pmol的正向和反向引物、2.5 mM的dNTP混合物、2.0 μL的10×Ex Taq缓冲液（50 mM KCl、20 mM Tris–HCl（pH 8.0）、2.0 mM MgCl?）以及1.0 U的Ex Taq聚合酶（Inclone Biotech Co.，IN5001）。正向和反向引物的信息见补充数据。使用无核酸酶的水（QIAGEN，型号129114）将总反应体积调整至20 μL。PCR条件如下：预变性步骤在94°C下进行3分钟，随后是30个循环的变性（94°C下30秒）、退火（58°C下30秒）和延伸（72°C下30秒），最后在72°C下进行3分钟的延伸。通过将PCR产物与6×loading dye（SIGMA，型号G2526-5ML，美国密苏里州圣路易斯）混合后进行电泳，电泳在含有EtBr（SIGMA，型号E1510；美国密苏里州圣路易斯）和1×Tris/borate/EDTA（TBE）缓冲液的1.2%琼脂糖凝胶上进行。目标区域的扩增通过UV透射仪（Bio-Rad，型号170-8070，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯）确认。

**通过基因本体论（GO）富集分析对QTL区域候选基因的功能表征**
进行基因本体论（GO）分析以确定通过QTL定位筛选出的候选基因的功能角色。使用水稻基因组组装（Oryza PanGenome Release 7.0，https://www.gramene.org）筛选QTL区域内的候选基因，并为每个候选基因分配注释信息。随后将GO术语分配给每个候选基因，并将其分类为细胞组分、分子功能或生物过程类别。使用AgriGO v2.0平台（https://systemsbiology.cau.edu.cn/agriGOv2/）进行GO富集分析。将分布在QTL区域内的候选基因列表作为输入数据，以识别过度表达的功能类别。为了提高分析的可靠性，应用了Fisher精确检验和Yekutieli的多重检验校正方法。此外，使用REVIGO（http://revigo.irb.hr/）去除冗余的GO术语并生成用于可视化表示显著富集功能类别的图表。

**RNA提取和转录水平分析**
在B. glumae接种后0、12、24、48、72、96和120小时，从Kele、IS592BB和KIRILs中采集穗样本。按照RNeasy Micro Kit（QIAGEN，型号74,004，德国Hilden）的制造商说明进行总RNA提取。按照qPCRBIO cDNA Synthesis Kit（PCRBIOSYSTEMS，美国）的制造商说明，使用1微克提取的RNA进行cDNA合成。然后将合成的cDNA以1:10（v/v）的比例用无核酸酶的水（QIAGEN，型号129114）稀释。根据qRT-PCR Master Mix（BIOFACT，型号RQ351-50h，韩国首尔）的制造商说明准备用于分析基因表达水平的反应混合物。使用Eco? Real-Time PCR System（Illumina，型号EC-900-1001，美国加利福尼亚州）进行基因表达分析。为了标准化每个样本的循环阈值，使用管家基因OsACTIN作为标准，并使用补充表S1中提供的相应引物集扩增候选基因。使用无核酸酶的水（QIAGEN，型号129114）将总反应体积调整至20 μL。PCR条件如下：预变性步骤在94°C下进行3分钟，随后是30个循环的变性（94°C下30秒）、退火（58°C下30秒）和延伸（72°C下30秒），最后在72°C下进行3分钟的延伸。通过与6×loading dye（SIGMA，型号G2526-5ML，美国密苏里州圣路易斯）混合后进行PCR产物的检测，然后在含有EtBr（SIGMA，型号E1510；美国密苏里州圣路易斯）和1×Tris/borate/EDTA（TBE）缓冲液的1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳。使用UV透射仪（Bio-Rad，型号170-8070，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯）确认目标区域的扩增。

**通过基因本体论（GO）富集分析对QTL区域候选基因的功能表征**
进行基因本体论（GO）分析以确定通过QTL定位筛选出的候选基因的功能角色。使用水稻基因组组装（Oryza PanGenome Release 7.0，https://www.gramene.org）筛选QTL区域内的候选基因，并为每个候选基因分配注释信息。随后将GO术语分配给每个候选基因，并将其分类为细胞组分、分子功能或生物过程类别。使用AgriGO v2.0平台（https://systemsbiology.cau.edu.cn/agriGOv2/）进行GO富集分析。将分布在QTL区域内的候选基因列表作为输入数据，用于识别过度表达的功能类别。为了提高分析的可靠性，应用了Fisher精确检验和Yekutieli的多重检验校正方法。此外，使用REVIGO（http://revigo.irb.hr/）去除冗余的GO术语并生成用于可视化表示显著富集功能类别的图表。

**RNA提取和转录水平分析**
在B. glumae接种后0、12、24、48、72、96和120小时，从Kele、IS592BB和KIRILs中采集穗样本。按照RNeasy Micro Kit（QIAGEN，型号74,004，德国Hilden）的制造商说明进行总RNA提取。按照qPCRBIO cDNA Synthesis Kit（PCRBIOSYSTEMS，美国）的制造商说明，使用1微克提取的RNA进行cDNA合成。然后将合成的cDNA以1:10（v/v）的比例用无核酸酶的水（QIAGEN，型号129114）稀释。根据qRT-PCR Master Mix（BIOFACT，型号RQ351-50h，韩国首尔）的制造商说明准备用于分析基因表达水平的反应混合物。使用Eco? Real-Time PCR System（Illumina，型号EC-900-1001，美国加利福尼亚州）进行基因表达分析。为了标准化每个样本的循环阈值，使用管家基因OsACTIN作为标准，并使用补充表S1中提供的相应引物集扩增候选基因。使用2^-ΔΔCt方法计算每个样本的相对表达水平。

**OsBGq1的单倍型分析和变异**
从RiceVarMap v2.0（https://ricevarmap.ncpgr.cn/）中可用的4726个水稻序列中识别OsBGq1的变异。使用在OsBGq1上游1 kb区域内识别的13个SNP变异（vg0133816358、vg0133816465、vg0133816958、vg0133817050、vg0133817242、vg0133817697、vg0133817698、vg0133817729、vg0133817982、vg0133817983、vg0133818572、vg0133818578、vg0133820555）进行单倍型分析。结果，识别出五种具有不同基因型的不同单倍型。

**H?O?的检测和定量**
使用DAB染色方法检测B. glumae在水稻穗中诱导的H?O?积累。在接种后五天采集接种了B. glumae的穗样本。为了确保DAB溶液充分渗透到细胞中，立即用蒸馏水（DW）冲洗样本穗以去除表面污染物。然后将穗完全浸入1 mg/mL的DAB溶液（pH 3.8）中。通过在黑暗中以130 RPM的速度振荡25°C孵育16小时进行染色反应。16小时后，去除DAB溶液，并用100%乙醇对穗进行脱色。由于B. glumae感染而产生H?O?的区域在穗上表现为棕色斑点。使用ImageJ软件（https://imagej.nih.gov/ij/）定量和比较H?O?水平。从不同的Kele、IS592BB和KIRILs植物中采集十个穗样本并进行DAB染色。图中展示了代表性图像。此外，还遵循Rao等人（2000年）提出的改进方法提取和分析每个穗中的H?O?（Rao等人，2000年）。根据Quantitative Peroxide Assay Kit（Thermo Fisher Scientific，型号23,280，美国马萨诸塞州）的制造商说明分析穗中的H?O?含量。使用已知H?O?浓度构建的标准曲线，测量提取物的吸光度值OD???。

**MDA、CAT、POD和Proline含量的分析**
按照Bates等人（1973年）的方法分析穗中的Proline含量（Bates等人，1973年）。将接种了B. glumae的穗研磨成5克粉末。然后将粉末样品与3%的磺osalicylic acid（w/v，SIGMA，型号S2130，SL，美国）在100°C下混合10分钟。样品在4500 RPM下离心30分钟，然后将2 mL的上清液转移到新的Eppendorf管中。向Eppendorf管中的上清液加入等体积的冰醋酸和酸 ninhydrin。混合物在100°C下加热40分钟，随后在冰上冷却。最后，通过测量OD520处的吸光度确定B. glumae存在下的Proline水平。

**Malondialdehyde（MDA）含量的分析**
按照Heath和Packer（1968年）的方法分析MDA含量（Heath和Packer 1968）。将穗样品研磨成1克粉末，并加入10%的三氯乙酸（v/v）。在4500 RPM下离心10分钟后，将2 mL的上清液转移到新的Eppendorf管中。向上清液中加入等体积的thiobarbituric acid，然后在100°C下加热40分钟，随后在冰上冷却。最后，通过测量OD520处的吸光度确定B. glumae存在下的MDA含量。

**Catalase（CAT）活性的分析**
通过修改和应用Beers和Sizer（1952年）的方法分析CAT活性（Beers和Sizer 1952）。反应混合物包括2 mL的磷酸钠缓冲液（50 mM，pH 7.0）、0.5 mL的H?O?（40 mM）和0.5 mL的酶提取物，总体积为3.0 mL。最后，通过测量OD240处的吸光度分析H?O?的分解。

**Superoxide dismutase（SOD）活性的分析**
使用Duan等人（2012年）的方法分析SOD活性（Duan等人，2012）。SOD活性定义为抑制NBT氯化物光化学还原所需的最小酶量，以OD560表示。

**Peroxidase（POD）活性的分析**
使用Weydert和Cullen（2010年）提出的guaiacol氧化方法确定POD活性（Weydert和Cullen 2010）。反应混合物包括2 mL的醋酸钠缓冲液（50 mM，pH 5.0）、0.5 mL的guaiacol（20 mM）和0.4 mL的H?O?（40 mM），总反应体积为3.0 mL。在反应开始后的前3分钟内，每隔1分钟测量一次OD240的OD值。

**通过LC-MS/MS分析量化水稻中的phytoalexins**
在B. glumae接种后五天采集穗样本，以量化水稻穗中产生的phytoalexins。将样本在液氮中研磨成100毫克粉末组织。将4毫升80%甲醇与100毫克粉末组织彻底混合，并在4°C和150 RPM的摇床中孵育过夜。将1毫升提取物转移到新的Eppendorf管中，并在4°C下以13,000 RPM离心10分钟。离心后，使用不含细胞碎片的5 μL上清液进行LC-MS/MS分析。进行三次独立实验。监测转换设置如下：phytocassanes A和E，m/z 317→299；phytocassane B，m/z 335→317；phytocassane C，m/z 319→301；momilactone A，m/z 315→271；momilactone B，m/z 331→269。

**对水稻壳中B. glumae的扫描电子显微镜（SEM）分析**
为了对水稻壳进行SEM分析，使用手术刀（SIGMA，型号S2646，美国密苏里州圣路易斯）切割壳，以分离内外表面。每个样本在真空下使用离子溅射装置（JEOL，型号JFC-1100E，日本东京）镀金。使用扫描电子显微镜（JSM-6390LV，JEOL）观察B. glumae接种后的水稻壳形态，加速电压为10 kV，点大小为30 nm。实验进行三次独立重复，图中展示了最具代表性的图像。

**统计分析**
使用R（版本4.1.3，The R Foundation for Statistical Computing）对与B. glumae感染相关的表型数据进行了统计分析。为了获得表型数据，使用B. glumae接种五株植物，从中随机选择三株。从每株选定的植物中随机采集五个穗。所有表型数据都进行了五次独立重复的统计分析，包括平均值和标准差比较。使用R中的agricolae包实现的Duncan’s multiple range test（DMRT）进行测量特征的统计分析。通过DMRT、单因素方差分析（ANOVA）和t检验获得的结果在P<0.05的水平上被评估为显著。对B. glumae抗性的评估在已作图谱的群体中进行。为了进行B. glumae抗性的QTL定位，研究了受感染穗中的以下参数：田间抗性评分、病害面积比例（%）、DAB染色强度以及病穗比例（%）（图1A，B）。在所有研究的参数中，Kele的表现都低于IS592BB，包括田间抗性评分（Kele 3.1±0.8，IS592BB 8.5±1.3）、病害面积比例（35.27±1.8%，78.85±2.5%）、DAB染色强度（311.22±3.5，358.65±2.8）以及病穗比例（33.2±2.5%，95.9±3.8%）。此外，KIRILs中研究的所有表型参数都表现出广泛的变化范围，涵盖了Kele和IS592BB观察到的值，并有跨代分离的证据。抗性评分和DAB染色强度的直方图显示正态分布，而病害面积比例则呈现双峰分布，病穗比例则遵循右偏分布。对研究参数的相关性分析显示所有参数之间的相关性均为0.5或更高（补充图S1）。值得注意的是，田间抗性评分与病穗比例之间的相关性最高（r=0.96）。DAB值与抗性评分之间以及DAB值与病穗比例之间也检测到了强相关性（r=0.91，r=0.89）。

在KIRILs中鉴定与B. glumae抗性相关的QTLs
在染色体1上的Chr01_24592710-Chr01_37274755区域内，鉴定了四个不同的QTL（qFRS1、qRDS1、qQDS1和qRDA1），这些QTL与B. glumae损害的水稻穗中的参数相关，包括田间抗性评分、病害面积比例（%）、DAB染色强度以及病穗比例（%）（补充表S2）。在Chr01_24592710-Chr01_37274755区域内鉴定的QTL包括qFRS1 [LOD: 5.98，表型变异解释（PVE）：15.41%] 和 qRDS1 (LOD: 5.29，PVE: 18.56%）。此外，在Chr01_24592710-Chr01_37274755区域内还鉴定了qQDS1 (LOD: 9.58，PVE: 22.02%) 和 qRDA1 (LOD: 8.44，PVE: 31.59%)。因此，染色体1上的Chr01_24592710-Chr01_37274755区域代表了一个通过B. glumae感染穗的表型分析鉴定出的重叠QTL，每个性状都有不同的LOD分数和PVE值。

对与B. glumae抗性相关的候选基因的精细定位和筛选
在KIRILs中感染B. glumae后，测量了田间抗性评分、病害面积比例（%）、DAB染色强度以及病穗比例（%）。在染色体1上的Chr01_24592710-Chr01_37274755区域内鉴定出一个与抗性相关的QTL，并根据各自的基因型对KIRILs进行了分类（图2）。对Kele、IS592BB和189个KIRILs中的六个标记（Chr01_33340511、Chr01_33472174、Chr01_33838140、Chr01_34249454、Chr01_34327765、Chr01_37052448）在该QTL区域内进行了基因型分析。结果，鉴定出了五个主要的重组体（KIRIL1、KIRIL2、KIRIL3、KIRIL4和KIRIL5）。KIRIL1、KIRIL2和KIRIL4的田间抗性评分、病害面积比例（%）和DAB染色强度与Kele相似。因此，QTL区域的基因组区间被缩小到Chr01_33472174和Chr01_33838140之间。根据Rice Annotation Project Database的数据，有16个候选基因位于Chr01_33472174和Chr01_33838140标记区间内：Os01g0794400、Os01g0794500、Os01g0795000、Os01g0796400、Os01g0797600、Os01g0797800、Os01g0798900、Os01g0799000（OsBGq1）、Os01g0799500、Os01g0799900、Os01g0800300、Os01g0800400、Os01g0800500、Os01g0801000、Os01g0801500和Os01g0801600。这些候选基因的描述见补充表S3。

图2
对KIRILs中染色体1上的Chr01_24592710-Chr01_37274755区域进行精细定位，以筛选与B. glumae抗性相关的候选基因。黑色条形代表来自Kele（抗性水稻品种）的染色体片段，而白色条形表示从IS592BB（易感水稻品种）继承的片段。在Chr01_24592710–Chr01_37274755区域内加入了六个额外的标记（Chr01_33340511、Chr01_33472174、Chr01_33838140、Chr01_34249454、Chr01_34327765和Chr01_37052448）。在KIRILs中，这些标记鉴定了五种不同的基因型。KIRIL1、KIRIL2、KIRIL3、KIRIL4和KIRIL5是从Kele和IS592BB杂交中衍生出的代表性重组自交系，每个都在KIRIL群体中携带不同的重组基因型。在B. glumae感染后，测量了表型参数（RDA、DS、RS和RDS），并在基因型信息右侧进行了总结。该图展示了位于Chr01_33472174–Chr01_33838140区域内的16个候选基因的分布。蓝色框的大小代表基因组DNA序列的相对长度，箭头的方向表示候选基因的转录方向。数据以每条线的五个独立生物重复实验的平均值±标准差显示。具有相同字母的平均值在统计上没有显著差异（P<0.05），这是通过Duncan的多重范围测试确定的。

候选基因的功能特征化的GO富集分析
使用AgriGO v2.0对Chr01_33472174和Chr01_33838140区域内筛选的候选基因进行了GO富集分析，显著性阈值设定为P<0.01和FDR<0.05。鉴定的GO术语被分为三个主要类别，即生物过程、细胞成分和分子功能，每个类别进一步细分（图3）。在生物过程类别中鉴定了五个GO术语（图3A），其中最富集的术语依次为：GO:0043086（催化活性的负调控）、GO:0044092（分子功能的负调控）、GO:0050790（催化活性的调控）和GO:0065009（分子功能的调控）。在细胞成分类别中鉴定了十六个GO术语（图3B），其中最富集的术语依次为：GO:0009536（质体）、GO:0016023（细胞质膜包裹的囊泡）、GO:0031410（细胞质囊泡）、GO:0043229（细胞内膜包裹的细胞器）、GO:0031988（膜包裹的囊泡）、GO:004444（细胞质部分）、GO:0043229（细胞内细胞器）、GO:0043227（膜包裹的细胞器）、GO:0031982（囊泡）、GO:0005737（细胞质）、GO:0043226（细胞器）、GO:004442（细胞内部分）、GO:005622（细胞内）和GO:004446（细胞部分）。在分子功能类别中鉴定了十二个GO术语（图3C），其中最富集的术语依次为：GO:0004252（丝氨酸型内肽酶活性）、GO:0042802（相同蛋白质结合）、GO:0008236（丝氨酸型肽酶活性）、GO:0017171（丝氨酸水解酶活性）和GO:0008233（肽酶活性）。

图3
在Chr01_33472174–Chr01_33838140区域内筛选的与B. glumae抗性相关的候选基因的GO术语和途径注释。使用AgriGO进行了候选基因的单一富集分析（SEA），并将基因分为三类：分子功能、生物过程和细胞成分。每个GO术语及其对应的ID显示在框内，显著富集的GO术语（P<0.01，FDR<0.05）用不同的颜色突出显示以表示统计显著性。生物过程A类别包含六个子类别，细胞成分B类别包含16个子类别，分子功能C类别包含12个子类别。途径可视化中的渐变阴影表示GO术语的富集程度，颜色强度与富集水平正相关，并指示相应的p值。

通过qRT-PCR分析候选基因的表达水平
为了确定候选基因的影响，通过qRT-PCR分析了B. glumae损害植物中的候选基因表达水平，包括Kele、IS592BB、KIRIL1、KIRIL2、KIRIL3、KIRIL4、KIRIL5、Hitomebore、Satojiman和Akitakomachi植物（图4）。Kele是一种抗B. glumae的水稻品种。KIRIL1、KIRIL2、KIRIL3、KIRIL4和KIRIL5是从Kele和IS592BB杂交中衍生出的RILs，代表KIRIL群体中的不同基因型。KIRIL1、KIRIL2和KIRIL4在Chr01_33472174和Chr01_33838140区域内与Kele具有相同的基因型，而KIRIL3和KIR5在该区域内具有IS592BB基因型。Kele是一种高度抗B. glumae的水稻品种，而IS592BB、Hitomebore、Satojiman和Akitakomachi对B. glumae高度敏感。通过精细定位鉴定的16个候选基因[Os01g0794400、Os01g0794500、Os01g0795000、Os01g0796400、Os01g0797600、Os01g0797800、Os01g0798900、Os01g0799000（OsBGq1）、Os01g0799500、Os01g0799900、Os01g0800300、Os01g0800400、Os01g0800500、Os01g0801000、Os01g0801500和Os01g0801600]的表达水平在B. glumae接种后0、6、12、24、48、72和120小时分别进行了测量。分析在Kele、IS592BB、KIRIL1、KIRIL2、KIRIL3、KIRIL4、KIRIL5、Hitomebore、Satojiman和Akitakomachi中进行。Os01g0794400、Os01g0796400、Os01g0797600、Os01g0799900和Os01g0800400的表达水平在B. glumae感染后上调，但在Kele、KIR1、KIR4（属于Chr01_33472174–Chr01_33838140区域的Kele类型）以及KIR3和KIR5（属于Chr01_33472174–Chr01_33838140区域的IS592BB类型）和易感水稻品种IS592BB、Hitomebore、Satojiman、Akitakomachi中保持一致。Os01g0794500、Os01g0799500和Os01g0801500的表达水平在B. glumae接种后48小时内在Kele、KIR1、KIR2和KIR4中高于KIR3、KIR5、IS592BB、Hitomebore、Satojiman和Akitakomachi。然而，在接种后72小时，这些基因的表达水平在所有基因型中趋于一致。Os01g0800500、Os01g0799000和Os01g079900的表达水平在B. glumae接种后120小时内在Kele、KIR1、KIR2和KIR4中高于KIR3、KIR5、IS592BB、Hitomebore、Satojiman和Akitakomachi。然而，在接种后24小时，这些基因的表达水平在所有基因型中趋于一致。Os01g0799000（OsBGq1）的表达水平在B. glumae接种后120小时内在Kele、KIR1、KIR2和KIR4中高于KIR3、KIR5、IS592BB、Hitomebore、Satojiman和Akitakomachi。相比之下，Os01g0797800、Os01g0800300、Os01g0801000和Os01g0801600的表达水平在整个120小时期间始终保持较低，Kele、IS592BB、KIR1、KIR2、KIR3、KIR4、KIR5、Hitomebore、Satojiman和Akitakomachi之间没有差异。

图4
分析与B. glumae抗性相关的潜在候选基因的表达水平。在Kele、IS592BB、KIRILs、Hitomebore和Akitakomachi中分析了染色体1上Chr01_33472174–Chr01_33838140区域内筛选的16个候选基因的表达水平。在B. glumae处理后0、6、12、24、48、72和120小时分别从每条线中取样穗子，以及对照样本，以比较筛选出的候选基因的相对表达水平。OsBGq1在KIR1、KIR2和KIR4中的表达水平在B. glumae感染后急剧增加。表达水平持续增加到感染后24小时，之后趋于下降。然而，在Kele、KIR1、KIR2和KIR4中，OsBGq1的表达水平始终高于IS592BB、Hitomebore和Akitakomachi。ns表示无显著差异。*在0.05水平上显著不同。**在0.01水平上显著不同。

Os01g0799000（OsBGq1）在籼稻和粳稻之间的序列变异
为了确定OsBGq1变异对B. glumae抗性的影响，使用RiceVarMap v2.0数据库在上游、外显子、内含子和下游区域共鉴定出13个序列变异（图5）。这些变异包括SNP1（G>T）、SNP2（A>T）、SNP3（G>C）、SNP4（C>T）、SNP5（G>C）、SNP6（A>C）、SNP7（G>A）、SNP8（A>T）、SNP9（A>G）、SNP10（G>T）、SNP11（G>T）、SNP12（T>C）和SNP13（C>T）。基于这些变异，4,713个水稻样本被分为五个不同的单倍型（Hap1、Hap2、Hap3、Hap4和Hap5）。Hap1由41.9%的籼稻、8.0%的澳稻和45.5%的粳稻组成。相比之下，Hap2由97.0%的籼稻、0.5%的澳稻和1.1%的粳稻组成，而Hap3由98.3%的籼稻和0.0%的澳稻和粳稻组成。Hap4没有子组（0.0%），Hap5仅存在于籼稻中（100.0%）。在Kele品种中，OsBGq1序列对应于Hap2单倍型。Hap2变异对于旨在提高粳稻B. glumae抗性的育种计划具有显著潜力。

图5
OsBGq1 DNA序列的单倍型分类。在OsBGq1的上游、下游、外显子和内含子区域共检测到13个SNP。其中，10个SNP位于外显子中，一个SNP位于内含子中，其余两个SNP位于上游区域。Hap1在籼稻（42.0%）和粳稻（45.6%）中的频率相似，而Hap2、Hap3、Hap4和Hap5主要存在于籼稻中。

B. glumae诱导的氧化应激指标的调节
B. glumae感染会诱导脯氨酸、H?O?和MDA以及酚类物质水平的变化，这些都是氧化应激的指标（图6A）。在感染前（预处理），Kele、IS592BB、KIRIL1、KIRIL2、KIRIL3、KIRIL4、KIRIL5、Hitomebore和Satojiman之间的脯氨酸、H?O?、MDA和酚类物质水平没有差异，所有品种都表现出相似的基线水平。然而，在B. glumae感染后，所有研究品系的脯氨酸、H?O?、MDA和酚类物质水平都增加。值得注意的是，Kele、KIR1、KIR2和KIR4的脯氨酸和酚类物质水平较高，而H?O?和MDA的水平低于KIR3、KIR5、IS592BB、Hitomebore和Satojiman。

序列变异
为了确定Os01g0799000（OsBGq1）在籼稻和粳稻之间的影响，使用RiceVarMap v2.0数据库在上游、外显子、内含子和下游区域共鉴定出13个序列变异（图5）。这些变异包括SNP1（G>T）、SNP2（A>T）、SNP3（G>C）、SNP4（C>T）、SNP5（G>C）、SNP6（A>T）、SNP7（G>A）、SNP8（A>T）、SNP9（A>G）、SNP10（G>T）、SNP11（G>T）、SNP12（T>C）和SNP13（C>T）。根据这些变异，4,713个水稻样本被分为五个不同的单倍型（Hap1、Hap2、Hap3、Hap4和Hap5）。Hap1由41.9%的籼稻、8.0%的澳稻和45.5%的粳稻组成。相比之下，Hap2由97.0%的籼稻、0.5%的澳稻和1.1%的粳稻组成，而Hap3由98.3%的籼稻和0.0%的澳稻和粳稻组成。Hap4没有子组（0.0%），Hap5仅存在于籼稻中（100.0%）。在Kele品种中，OsBGq1序列对应于Hap2单倍型。Hap2变异对于提高粳稻B. glumae抗性的育种计划具有显著潜力。这些结果表明，Chr01_33472174和Chr01_33838140区域的Kele型基因能够调节氧化应激指标，从而减弱氧化应激反应，并增强对B. glumae的抗性。图6显示，引入了Chr01_33472174–Chr01_33838140区域的KIRILs能够有效清除ROS（活性氧），并提高对B. glumae的抗性。A) 在所有感染B. glumae的水稻品系中，包括Kele、IS592BB、KIRILs、Hitomebore、Satojiman和Akitakomachi，都观察到了脯氨酸、H?O?、MDA和酚类物质的积累，以及SOD、POD和CAT等ROS清除酶活性的变化，以及DPPH清除能力的变化。由于SOD、POD和CAT活性的提高以及DPPH清除能力的增强，Kele、KIRIL1、KIRIL2和KIRIL4的脯氨酸、H?O?、MDA和酚类物质的积累量低于IS592BB、KIRIL3、KIRIL5、Hitomebore和Akitakomachi。因此，Kele、KIRIL1、KIRIL2和KIRIL4表现出对B. glumae的更强抗性。B) 通过DAB染色发现，B. glumae在Kele、IS592BB、KIRILs、Hitomebore、Satojiman和Akitakomachi中诱导的H?O?形成了棕色斑点。DAB染色结果显示，Kele、KIRIL1、KIRIL2、KIRIL3和KIRIL4的棕色斑点数量少于IS592BB、Hitomebore和Akitakomachi。其中，KIRIL1、KIRIL2和KIRIL4的棕色斑点形成程度与Kele相似。图像中的穗代表每个品系五个独立生物学重复实验的最具代表性的结果。条形图表示平均值±标准差，根据Duncan的多重范围检验，标记相同字母的平均值之间没有显著差异（P<0.05）。此外，在处理前，包括Kele、IS592BB、KIRIL1、KIRIL2、KIRIL3、KIRIL4、KIRIL5、Hitomebore和Akitakomachi在内的所有研究品系的抗氧化酶SOD、POD和CAT的活性相似，没有显著差异（图6A）。然而，在感染B. glumae后，所有品系的SOD、POD和CAT活性都比感染前有所增加。与KIRIL3、KIRIL5、IS592BB、Hitomebore和Akitakomachi相比，Kele、KIRIL1、KIRIL2和KIRIL4的SOD、POD和CAT活性显著增加。此外，Kele、KIRIL1、KIRIL2和KIRIL4的DPPH清除活性也高于KIRIL3、KIRIL5、IS592BB、Hitomebore和Akitakomachi。这些结果表明，来自Kele的Chr01_33472174和Chr01_33838140区域通过增加抗氧化酶SOD、POD和CAT的活性以及提高DPPH清除活性来增强抗性，从而调节ROS水平（图6B）。

植物抗性物质的积累增强了对B. glumae的抗性。对感染B. glumae的穗中植物抗性物质（包括momilactone A、momilactone B、phytocassane B、phytocassane C、phytocassane E和sakuranetin）的积累进行了定量分析，并在不同水稻品系之间进行了比较。实验结果显示（图7A），B. glumae感染诱导了这些植物抗性物质在水稻穗中的积累。在所有研究的品系中，包括Kele、IS592BB、KIRIL1、KIRIL2、KIRIL3、KIRIL4、KIRIL5、Hitomebore和Akitakomachi，感染B. glumae后momilactone A、momilactone B、phytocassane B、phytocassane C、phytocassane E和sakuranetin的积累量均有所增加。然而，Kele、KIRIL1、KIRIL2和KIRIL4的这些植物抗性物质的积累量显著高于KIRIL3、KIRIL5、IS592BB、Hitomebore和Akitakomachi。这些结果表明，Kele、KIRIL1、KIRIL2和KIRIL4中这些植物抗性物质的增加有助于提高对B. glumae的抗性。

图7显示了感染B. glumae的水稻穗中植物抗性物质（momilactone A、momilactone B、phytocassane B、phytocassane C、phytocassane E和sakuranetin）的积累情况。A) 比较了正常条件和感染B. glumae后5天（150小时）水稻穗中这些植物抗性物质的积累水平。在正常条件下，所有研究品系中的植物抗性物质积累量较低。然而，在感染B. glumae后5天，Kele、KIRIL1、KIRIL2和KIRIL4中的植物抗性物质积累量显著增加。相比之下，IS592BB、Hitomebore和Akitakomachi的植物抗性物质积累量相对较低。B) 使用扫描电子显微镜（SEM）分析了感染水稻穗的小穗表面和内部组织中的B. glumae存在情况。红色箭头表示B. glumae。在Kele、KIRIL1、KIRIL2和KIRIL4中，B. glumae在表面和内部组织中的数量非常少。相比之下，IS592BB、Hitomebore和Akitakomachi的小穗表面有大量的B. glumae覆盖，内部组织也有显著的定殖现象。条形图表示平均值±标准差。根据Duncan的多重范围检验，标记相同字母的平均值之间没有显著差异（P<0.05）。K表示Kele，I表示IS592BB，K1表示KIRIL1，K2表示KIRIL2，K3表示KIRIL3，K4表示KIRIL4，K5表示KIRIL5，H表示Hitomebore，S表示Satojiman，A表示Akitakomachi。感染B. glumae后5天，使用SEM观察了Kele、IS592BB、KIRIL1、KIRIL2、KIRIL3、KIRIL4、KIRIL5、Hitomebore和Akitakomachi的穗中的小穗。尽管所有品系中都观察到了B. glumae的扩散，但其扩散程度各不相同。在KIRIL5、IS592BB、Hitomebore和Akitakomachi中，B. glumae完全覆盖了小穗表面；而在Kele、KIRIL1、KIRIL2和KIR4中，B. glumae要么没有观察到，要么数量非常少。这种效应在小穗的外表面比内部更为明显。

讨论：由B. glumae在水稻抽穗期引起的BGR（Bacterial Glume Rot）会导致每个小穗上形成棕色斑点，直接导致小穗不育（Zhou-qi等人，2016年）。这种感染会扰乱水稻的成熟过程，最终导致产量损失（Benchlih等人，2025年）。迄今为止，已经报道了两个与B. glumae抗性相关的QTL：位于1号染色体上的RBG2（Mizobuchi等人，2015年）和位于3号染色体上的qBPB-3-2（Pinson等人，2010年）。然而，尚未发现其他QTL，且这些QTL尚未被精细定位到特定的基因区域。B. glumae诱导的疾病的发展受到接种时环境条件的强烈影响，使得田间接种特别具有挑战性（Seo等人，2015年）。因此，先前报道的RBG2是基于体外研究确定的（Mizobuchi等人，2013年）。由于育种受到环境因素的强烈影响，体外研究的结果可能并不总是适用于实际田间条件（Teressa等人，2021年）。特别是，RBG2最初被报道为一个大约502 kb的宽QTL区域，没有进一步细化或系统筛选候选基因（Mizobuchi等人，2015年）。相比之下，通过基于图像的表型分析，本研究能够缩小QTL区间，并确定了16个可能与BGR抗性相关的候选基因，其中OsBGq1被选为潜在的抗性相关候选基因。

在这项研究中，使用了遗传上不同的生态型Kele（籼稻）和IS592BB（粳稻）来识别与BGR抗性相关的候选基因。籼稻生态型具有由生物胁迫适应形成的独特等位基因变异，已被广泛用于识别对稻瘟病（Khan等人，2018年）和细菌性叶枯病（Suh等人，2013年）的抗性基因。相比之下，粳稻代表了一个具有农艺重要性状的遗传上不同的群体。籼稻和粳稻之间的显著遗传距离增加了多态性密度，提高了遗传图构建的分辨率（Wang等人，2012年），从而增强了精确识别与BGR抗性相关的QTL的能力。准确的表型评估对于成功的QTL定位至关重要（Houle等人，2010年）。表型评估中的错误可能导致检测到与目标性状无关的QTL，从而影响研究的可靠性（Yang等人，2020年）。主观或模糊的表型评估方法会削弱基因型与表型之间的关联，从而降低QTL检测的能力（Gro?kinsky等人，2015年）。已知Kele对B. glumae具有高抗性。然而，Kele的稻壳颜色为黑色，在Kele/IS592BB RIL群体（KIRILs）中，稻壳颜色有所不同，表现出黑色和棕色的色调。这种变异使得通过视觉区分B. glumae感染引起的症状特别具有挑战性。因此，为了更精确地评估B. glumae感染造成的损害，本研究使用了DAB染色方法，并利用基于扫描仪的图像数据进行定量分析。这种方法能够可视化并量化组织内的ROS积累，从而更系统地评估受感染植物的应激反应（Hu等人，2017年）。与传统视觉评估方法相比，这种方法能够进行更精确的表型分析，并有望提供关于植物对B. glumae感染反应机制的关键见解（Araus和Cairns，2014年）。ROS的短暂增加对于激活植物防御信号至关重要；然而，过量或持续的ROS积累会对宿主组织造成氧化损伤并促进疾病进展（Torres等人，2006年）。在本研究中，与OsBGq1表达增加相关的ROS水平降低可能反映了疾病发展过程中ROS稳态的改善，这可能有助于增强对BGR的抗性。

与传统的评估方法相比，图像分析允许更精细的评估，并促进了精准农业的发展（Zhang和Kovacs，2012年）。传统评估方法与图像分析之间的比较显示了两者之间的强相关性，证明了这种方法的可可靠性。此外，图像分析还能够评估以前未检查的方面，进一步提高了表型评估的准确性（Li等人，2019年）。图像分析提高了农业的精确度和效率，其在育种中的应用最近被探索为精准育种的策略（Zhang和Kovacs，2012年）。Bai等人（2023年）利用无人机图像分析了疾病严重程度，以检测与细菌性叶枯病抗性相关的QTL（Bai等人，2023年）。通过将收集的数据应用于QTL定位，他们在11号染色体的R11D100–RM254区域识别出了qBB2R11a和qBB2R11b，在RM254–RM2064区域识别出了qBB2R11c和qBB3R11（Bai等人，2023年）。该区域富含先前被确定为细菌性叶枯病抗性主要贡献者的基因，包括Xa4（Hur等人，2016年）、Xa30（Yang等人，2022年）、Xa35（Fiyaz等人，2022年）和Xa36（Yang等人，2022年）。在本研究中，首次将DAB染色应用于Kele/IS592BB RIL群体，以量化疾病严重程度并分析应激反应。图像分析用于评估病斑面积和疾病严重程度。最终，1号染色体上Chr01_24592710-Chr01_37274755区域的区间被缩小到Chr01_33472174-Chr01_33838140区间。该区域靠近RBG2[28]，因此将基于DAB的定量表型分析与传统的QTL定位方法相结合，有望为旨在提高疾病抗性的育种计划提供客观指标。之前的体外研究在准确反映实际田间条件方面存在局限性（Khaled等人，2018年）。相比之下，本研究通过在田间直接喷洒B. glumae进行接种，评估了自然条件下的抗性表达，增强了这种方法的实用性和有效性。此外，图像分析还提高了抗性评估的准确性。结果，在1号染色体的Chr01_33472174-Chr01_33838140区间内识别出了与B. glumae抗性相关的QTL。在该区域内，Os01g0799000（OsBGq1）被筛选为潜在的抗性相关候选基因。我们提出OsBGq1通过快速降解感染引起的ROS并促进植物抗性物质的积累来增强对B. glumae的抗性。这些发现表明，OsBGq1的活性可能通过增加植物抗性物质的积累来限制真菌菌丝在稻穗中的扩展。

OsBGq1编码一个NLR结构域；这类结构域在植物免疫反应中起着关键作用，通过识别病原体并传递防御信号（Jones和Dangl，2006年）。FLS2和Xa21分别编码LRR结构域，用于识别细菌鞭毛蛋白和Xanthomonas病原体，从而激活防御反应（Di Gaspero和Cipriani，2003年）。LRR结构域作为转录因子调节抗菌基因的表达（Goff和Ramonell，2007年）。病原体入侵会激活水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）和乙烯（ET）信号通路，这些通路与PR基因和抗菌蛋白密切相关（Heil和Bostock，2002年）。拟南芥RPS2（Bent等人，1994年）和水稻Piz-t（Jeung等人，2007年）也编码LRR结构域，这些结构域调节植保素的合成和抗菌次生代谢产物的产生，从而提高病原体抗性（Elmore等人，2012年）。鉴于据报道水稻植保素sakuranetin对B. glumae具有抗真菌活性，携带Kele衍生基因型Chr01_33472174-Chr01_33838140的KIRIL1、KIRIL2和KIRIL4表现出增强的抗性，这提示了一种可能的机制。我们提出这种抗性至少部分是由OsBGq1的上调驱动的，导致植保素积累增加和ROS降解增强。因此，尽管OsBGq1似乎不直接合成抗菌化合物，但我们的数据表明它可能参与调控植物防御信号传导和与疾病抗性相关的蛋白质网络，从而增强对B. glumae的抗性。在这项研究中，OsBGq1与其他编码LRR结构域的基因一起，被认为是植物免疫反应和抗菌次生代谢产物相关途径的潜在调控成分。然而，需要通过转基因或基因编辑方法进行直接的功能验证，以确认OsBGq1在病原体抗性中的确切作用。本研究提出，作为NLR家族成员的OsBGq1可能对B. glumae的抗性有积极作用。此外，水稻中的其他LRR受体成员也参与了多种应激反应，有助于提高对环境压力的抗性（Liu等人，2014年）。含有LRR受体结构域的基因被广泛认为是病原体抗性的主要贡献者。值得注意的是，几个含有LRR受体结构域的基因在抵抗Xanthomonas oryzae pv. oryzae（引起细菌性叶枯病的病原体）方面起着关键作用。例如，Xa4通过增强细胞壁来防止病原体入侵从而提高抗性，Xa10诱导程序性细胞死亡以赋予抗性（Gu等人，2008年），Xa13抑制病原体增殖（Chu等人，2004年）。此外，Pi-b（Chen等人，2018年）、Pi-kh（Wu等人，2013年）和Pi-9（Zhou等人，2020年）含有LRR受体结构域，在与Magnaporthe grisea（引起稻瘟病的病原体）不同菌株的相互作用中起着关键作用。这些基因激活防御反应，从而提高对稻瘟病的抗性。这些发现表明NLR结构域作为一种多功能调节因子，能够整合针对多种病原体的防御系统。

在Chr01_33472174–Chr01_33838140区域内筛选出的候选基因根据生物过程、细胞成分和分子功能类别中的富集GO术语表现出多样的功能特征。特别是GO:0050790（催化活性的调节）和GO:0044092（分子功能的负调控）显著富集，表明相关基因可能在调节特定酶活性和信号转导途径中起关键作用（Ashburner等人，2000年）。细胞成分相关因素的分析显示，包含GO:0005737（细胞质）和GO:0043226（细胞器）的基因表明它们可能参与细胞内信号转导和应激相关反应。从分子功能的角度来看，GO:0008233（肽酶活性）和GO:0017171（丝氨酸水解酶活性）显著富集，表明它们可能在应激条件下参与蛋白质降解和免疫反应。在Chr01_33472174-Chr01_33838140区域内筛选出的OsBGq1编码一个NLR结构域，表明其在应激条件下可能参与ROS调节和抗菌活性。NLR结构域通过识别病原体、调节ROS清除和信号转导途径在植物免疫反应中起关键作用（Grant和Loake，2000年）。因此，本研究中鉴定出的OsBGq1可能有助于水稻的免疫反应和适应环境压力。未来的研究应通过使用CRISPR/Cas9或过表达载体的转基因植物来验证OsBGq1的功能，以进一步阐明其作用（Liu等人，2017年）。值得注意的是，在QTL区间内鉴定的16个候选基因中，OsBGq1在B. glumae接种后的田间条件下表现出最高且最稳定的表达水平。当B. glumae在田间施用时，OsBGq1的表达水平明显高于其他抗性相关候选基因，而许多其他候选基因的表达模式表现出短暂诱导或显著变化。OsBGq1在实际感染条件下的稳定和高表达表明，该基因不仅对病原体挑战有反应，而且很可能在植物中有效发挥抗性作用。基于这种在田间接种条件下的优越表达表现，OsBGq1被选为最具潜力的细菌性粒腐病抗性候选基因。然而，同一QTL区间内的其他几个基因也可能对BGR抗性有贡献。这些基因包括参与病原体响应性转录调控（AP2/ERF）（Gutterson和Reuber，2004年）、氧化还原平衡和ROS介导的防御（硫氧还蛋白类和脱嘌呤内切酶）（Nadarajah，2020年）、程序性细胞死亡（半胱天冬酶样结构域蛋白）（Desaki等人，2006年）以及细胞壁降解（糖苷水解酶家族17）（Yang等人，2021年）的基因。总体而言，这些发现表明，该基因组区域对B. glumae的抗性可能由涉及病原体识别、免疫信号传导、氧化应激调节和局部细胞死亡的协调防御网络控制，而不仅仅是单个基因的作用。从这个角度来看，图像分析的应用有效地收集了用于识别抗性相关QTL和评估难以通过视觉检查区分的疾病症状的数据，从而提高了抗性评估的准确性（Mahlein，2016年）。随着全球温度的迅速上升加速了菌株分化并增加了疾病发生率，图像分析在数据收集中的应用为识别抗性相关QTL提供了精确的解决方案。这种方法为育种者提供了改进抗性育种策略的宝贵工具。图像数据的应用提供了与受控条件下获得的结果相当可靠的结果，同时能够更精确地缩小先前鉴定的QTL范围。

在这项研究中，我们提出OsBGq1可能作为调节因子对抗BGR抗性起作用。然而，由于这个QTL和候选基因是在特定地理和环境条件下使用单一对亲本群体鉴定的，它们在不同遗传背景和农业生态区的多种水稻品种中的有效性仍有待验证。因此，需要使用多种遗传背景和环境进行进一步验证，以评估OsBGq1相关抗性的更广泛适用性。此外，OsBGq1的精确分子功能及其在B. glumae感染期间在水稻生理反应中的作用仍不清楚。通过开发基于CRISPR/Cas9的基因编辑系或转基因植物进行功能验证对于阐明潜在的分子机制以及直接确定OsBGq1是否增强BGR抗性至关重要。这样的验证将是评估OsBGq1的实际价值及其在旨在提高抗性和开发适应未来气候相关挑战的水稻育种计划中的潜在应用的关键下一步。

结论

长期以来，通过育种来减轻全球温度上升及其导致的疾病发生率增加的影响一直是一个讨论的话题。本研究应用图像分析来评估B. glumae引起的症状，实现了精确的量化和数据收集。结果，成功将与B. glumae抗性相关的QTL缩小到1号染色体上的Chr01_33472174-Chr01_33838140区域。Chr01_33472174-Chr01_33838140区域的Kele类型KIRIL1、KIRIL2和KIRIL4表现出对B. glumae感染的增强抗性，这与ROS降解增加和植保素积累有关。在该区域内，OsBGq1被鉴定为与B. glumae抗性相关的潜在候选基因。OsBGq1在抗性水稻品种中的表达水平高于易感品种，从而清楚地区分了这两组。OsBGq1编码一个NLR结构域，这种蛋白质区域也存在于与细菌性叶枯病和稻瘟病抗性相关的基因中。根据13个SNP，OsBGq1被分为五种单倍型，其中Hap2是一种特定于Indica类型的单倍型，包含Kele。本研究通过图像数据收集和分析提供了一种高效且精确的育种策略，用于筛选与B. glumae抗性相关的QTL和候选基因。未来的研究将致力于通过开发转基因和基因编辑系来阐明OsBGq1的生理效应的分子机制。