苔藓中异戊二烯合酶的结构多样性源于多种萜类合酶谱系

《Journal of Biological Chemistry》：Structural diversity of isoprene synthases in mosses from multiple terpenoid synthase lineages

　　

异戊二烯是一种由多种陆生植物排放的C5烃类化合物，在高温胁迫下充当保护分子。苔藓植物Calohypnum plumiforme的异戊二烯合酶（CpISPS）能够催化二甲基烯丙基二磷酸（DMADP）形成异戊二烯，其活性位点底部含有两个芳香残基（Y393和F615），限制了空腔尺寸以适应较小的C5底物。研究表明这些残基是底物大小选择性的关键决定因素。将这两个残基替换为丙氨酸（Y393A和F615A）扩大了活性位点，并表现出二萜合酶活性，能够从ent-柯巴基二磷酸（ent-CDP）生成ent-海松二烯。通过对催化基序的进一步诱变，产生了ent-贝壳杉烯，展示了从二萜合酶到异戊二烯合酶活性的逐步功能转换。对苔藓中ISPS基因的筛选鉴定了两类结构不相关的酶：典型的二萜合酶型ISPS（如C. plumiforme和Pohlia nutans）和微生物型萜类合酶样蛋白（MTPSL）型ISPS（如Polytrichum commune和Leucobryum juniperoideum），后者代表了一种此前未被识别的ISPS支架。P. commune的MTPSL型ISPS（PcISPS）具有两个芳香残基（W151和F288），与CpISPS情况相同，用于限制空腔大小。扩大PcISPS活性位点的替换实验（W151A和F288A）确定了其产生罗勒烯的单萜合酶活性。这些结果定义了萜类合酶底物特异性的分子基础，并证明结构不同的酶家族可以独立获得ISPS活性。

论文解读：苔藓中异戊二烯合酶的结构多样性与功能演化

本研究聚焦于陆生植物中广泛存在的挥发性化合物异戊二烯（2-甲基-1,3-丁二烯）的生物合成机制。异戊二烯在植物应对高温和强光等非生物胁迫中发挥重要的保护作用。尽管在种子植物（被子植物和裸子植物）中，异戊二烯合酶（ISPS）的系统发育起源和结构基础已有较多研究，但在苔藓植物中，ISPS的分子机制及其结构多样性尚不清楚。特别是苔藓植物拥有独特的萜类生物合成酶系统，包括典型的植物萜类合酶（TPS）家族和微生物型萜类合酶样蛋白（MTPSL），这使得探究苔藓ISPS的进化起源和功能转换成为理解陆生植物ISPS多样性的关键。为此，研究人员开展了针对多种苔藓ISPS的结构与功能研究，相关成果发表在《Journal of Biological Chemistry》上。

在研究技术方法上，研究人员首先通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术定性定量分析了多种苔藓配子体的异戊二烯排放量。随后，结合转录组测序（RNA-seq）和基因组挖掘技术，在目标苔藓中鉴定了潜在的ISPS基因。利用AlphaFold2进行三维结构建模并结合POVME计算预测了酶活性位点的空腔体积。通过定点诱变技术构建了关键氨基酸残基突变体，并在大肠杆菌中表达重组蛋白，利用体外酶活测定实验验证了各突变体对不同底物（如DMADP、GDP、ent-CDP等）的催化活性。此外，还采用了实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析了热胁迫下ISPS基因的表达水平变化。

研究结果显示，通过对CpISPS的深入研究，发现其活性位点底部的两个芳香残基（Y393和F615）是底物大小选择性的关键。将二者突变为丙氨酸（Ala）后，活性位点空腔体积从232 ?³扩大至406 ?³，使得突变体能够接受更大的ent-柯巴基二磷酸（ent-CDP）作为底物，生成ent-海松二烯等二萜化合物。进一步引入ent-贝壳杉烯合酶（KS）特有的AxxPIx基序，成功使突变体获得了生成ent-贝壳杉烯的活性，证明了从二萜合酶向异戊二烯合酶的逐步功能转换路径。

在对多种苔藓目植物的筛选中，研究人员确认了Pohlia nutans（Bryales）、Polytrichum commune（Polytrichales）和Leucobryum juniperoideum（Archidiales）均能产生异戊二烯。进一步的基因鉴定揭示了两种截然不同的ISPS类型：一种是典型的二萜合酶型ISPS，存在于C. plumiforme和P. nutans中，它们具有β/α双结构域；另一种是新型的MTPSL型ISPS，存在于P. commune和L. juniperoideum中。

针对P. commune的研究表明，其ISPS（PcISPS）属于MTPSL家族，仅含有一个α结构域，且具有DDxxxD基序。其活性位点底部的两个芳香残基（W151和F288）同样起到了限制空腔大小的作用。将这两个残基突变为丙氨酸后，PcISPS转而表现出单萜合酶活性，能够利用香叶基二磷酸（GDP）生成罗勒烯。此外，fosmidomycin（一种MEP途径抑制剂）处理显著抑制了P. commune的异戊二烯生成，证实了其利用质体MEP途径来源的DMADP作为底物。

在P. nutans和L. juniperoideum中鉴定的ISPS基因也分别证实了上述两种类型的存在。值得注意的是，L. juniperoideum的MTPSL型ISPS（LjISPS）在其活性位点底部并未保守存在芳香残基，这暗示了除活性位点底部架构外，还存在其他决定底物识别的结构因子。

在生理响应方面，热胁迫实验表明，除C. plumiforme外，其余三种苔藓（P. nutans、P. commune和L. juniperoideum）在35°C下的异戊二烯排放量和ISPS基因表达量均显著高于25°C，这与被子植物中ISPS对高温的响应模式相似。

讨论部分总结指出，本研究通过实验证实了CpISPS起源于TPS-c亚家族的二萜合酶，并通过活性位点扩张和关键基序引入实现了功能的逐步转换。在苔藓中发现了两种结构迥异的ISPS类别：二萜合酶型和MTPSL型。前者在系统发育上远离种子植物的ISPS，代表了独立的进化事件；后者则是首次在ISPS中被鉴定，表明MTPSL家族中的特定亚群（Group II）也适应了异戊二烯的生物合成。尽管LjISPS缺乏典型的芳香残基限制机制，但其仍能特异性识别DMADP，提示了底物识别机制的复杂性。这项研究揭示了早期陆地植物中ISPS的分子和结构多样性，为理解陆生植物ISPS的进化关系和谱系分化提供了框架。