由于对苯并异噻唑啉酮的敏感性增加，促使开发了一种用于消费品中异噻唑啉酮类物质的通用分析方法

《Contact Dermatitis》：Development of a Generic Analysis Method for Isothiazolinones in Consumer Products Prompted by Increased Sensitisation to Benzisothiazolinone

　　摘要

背景
异噻唑啉酮类化合物被广泛用作化妆品和非化妆品产品的防腐剂。除了基线系列中包含的氯甲基异噻唑啉酮/甲基异噻唑啉酮（CMIT/MIT）之外，对其他异噻唑啉酮的敏感性正在增加。

目的
本研究旨在调查对苯基异噻唑啉酮（BIT）的敏感性发生率与CMIT/MIT的比较，并为配备基本仪器的实验室开发一种独立的异噻唑啉酮分析方法。

患者与方法
对803名连续接受测试的皮炎患者进行了含有BIT和CMIT/MIT的贴片测试。同时，还开发了一种适用于高效液相色谱-紫外光谱（HPLC-UV）的简单通用异噻唑啉酮分析方法。

结果
对14种标有含有BIT和/或CMIT/MIT的产品（包括化妆品和非化妆品）的分析显示，非化妆品中的BIT浓度高达272 ppm。检测到的CMIT和MIT的最大浓度分别为0.3 ppm和1.5 ppm。在一种未标注成分的业余用油漆中检测到了二氯辛基异噻唑啉酮和MIT。与CMIT/MIT相比，BIT是导致过敏的更常见原因，其发生率分别为7.7%和5.2%。

结论
研究结果证实了先前的报告，即瑞典西部皮炎患者中对BIT的敏感性正在增加。产品分析表明，在频繁且长时间接触皮肤的产品中，BIT的浓度可能比CMIT/MIT高几个数量级。

1 引言
所有类型的水基产品都需要使用防腐剂以防止细菌或真菌的生长。异噻唑啉酮类化合物是化妆品和非化妆品产品中最常用的防腐剂之一，例如化工/工业产品、家用洗涤剂和水基油漆[1]。欧洲的基线系列中包含了甲基异噻唑啉酮（MIT）和氯甲基异噻唑啉酮（CMIT），因为这些成分存在于许多化妆品中。由于异噻唑啉酮的使用量增加以及由此引发的敏感性问题，CMIT/MIT被禁止用于持久型产品，并在速洗型产品中的使用量被限制在15 ppm以内（表1）[2, 3]。这一法规的效果非常明显，研究表明，在法规实施前，对CMIT/MIT的敏感性峰值频率为9%–19%，而在法规实施后降至1.4%–3.2%[4, 5]。世界其他地区的法规略有不同（表2）。在美国，BIT和MIT都可以单独用于持久型化妆品。在亚洲，MIT的最大允许浓度为100 ppm，而日本允许在速洗型化妆品中同时使用CMIT/MIT的浓度高达1000 ppm[6, 7]。

然而，对于非化妆品产品的制造商来说，还有其他类型的异噻唑啉酮可供选择，这些产品不受化妆品指令的监管。与这些类型的产品接触皮肤的机会可能较多且时间较长。随着CMIT/MIT使用的减少，其他异噻唑啉酮正在逐渐替代它们。在瑞典，苯基异噻唑啉酮（BIT）的使用量有所增加[8]，并且在2014年，BIT成为丹麦化学产品中最常用的异噻唑啉酮[9]。动物研究表明BIT具有中等程度的致敏性[10]。室内和室外家用产品中BIT的最大允许浓度被规定为500 ppm（表1）。尽管如此，对BIT的敏感性仍在增加。英国和德国的研究显示，从2010年代的不到1%上升到2020年的3.4%–6.5%[4, 11]。研究发现，金属工人和油漆工以及男性患者中对BIT的敏感性显著高于女性患者[11]。我们之前在一项研究中发现，在连续接受贴片测试的皮炎患者中，BIT的敏感性发生率为4.4%，这些患者构成了对照组[12]。尽管BIT现已被纳入欧洲的基线系列[13]，但据我们所知，这是瑞典最近发布的关于BIT的连续贴片测试数据。尽管有相关法规，但防腐剂可能存在于化妆品和非化妆品产品中而未被标注，这使得难以确定异噻唑啉酮阳性贴片测试反应的临床意义。除了BIT之外，非化妆品产品中还发现辛基异噻唑啉酮（OIT）和二氯辛基异噻唑啉酮（DCOIT）的使用量也在增加[8]。因此，了解产品中常用异噻唑啉酮的存在及其浓度非常重要。已经发表了多种分析水基产品中异噻唑啉酮的方法，其中许多方法也适用于BIT[14-23]。这些研究主要集中在开发特定类型产品的分析方法上，如清洁产品[17]、其他类型的家用产品或化妆品[14, 20, 23]。还有其他方法适用于油漆和粘合剂[21, 24, 25]，或者用于测量空气中来自油漆的异噻唑啉酮低浓度[26]或从液体中释放到空气净化器中的异噻唑啉酮[24, 27, 28]。这些方法并不容易应用于不同类型产品的患者暴露情况调查。此外，由于仪器要求和样品制备方法的复杂性，许多不同的分析方法也不适用于其他实验室[29]。因此，需要一种通用的异噻唑啉酮分析方法，该方法适用于广泛使用异噻唑啉酮的各种产品，并且能够使用基本仪器和简单的样品制备步骤。本研究的目的是调查瑞典西部患者两年内对BIT的敏感性发生率，并为各种水基化妆品和非化妆品产品中MIT、CMIT和BIT的定量开发一种通用分析方法。该分析系统还设计为可以检测其他异噻唑啉酮（如有需要）。

2 患者与方法

2.1 分析方法
2.1.1 产品选择
研究重点关注消费者的暴露情况，选择了代表不同类别的产品，涵盖了室内和室外活动，这些产品是在2021年9月在瑞典哥德堡的五家不同公共商店购买的。入选产品的条件是其成分声明中至少含有一种异噻唑啉酮。共选择了14种产品：2种汽车洗发水、1种户外纺织品清洁剂、1种花园家具清洁剂、1种家用香水空气清新剂、1种空气清新喷雾、1种业余用胶水、1种墙漆、2种洗洁精、1种洗发水、1种护发素、1种液体洗手液和1种发型凝胶（表S1）。所涉及的异噻唑啉酮包括MIT、CMIT和BIT。此外，还加入了一个来自过敏性接触性皮炎（ACD）患者调查的业余用油漆样本。该产品的成分声明中未提及任何异噻唑啉酮。

2.1.2 分析用溶剂和物质
甲醇（Supelco LiChrosolv hypergrade for LC–MS）和醋酸（>99.7%）均用于样品制备和色谱分析，购自德国Sigma Aldrich公司。定量用的参考物质也购自Sigma Aldrich公司（美国圣路易斯）：CMIT和MIT以水溶液形式提供，比例为3:1（1.1%和0.4% w/w），而BIT、OIT和DCOIT则以98%纯度的晶体形式提供。

2.1.3 样品制备
像肥皂和洗涤剂这样的不含聚合物成分的产品在分析前需要稀释（程序A），而胶水和油漆产品则需要溶解、稀释并过滤离心（程序B）。两种程序都使用甲醇/去离子水（45/55体积比）+ 0.5%体积比的醋酸溶液进行异噻唑啉酮提取和样品溶解。程序A：将5克产品称重放入100毫升烧杯中，记录重量到小数点后两位，然后加入50毫升样品提取/稀释溶液。样品超声处理10分钟以促进提取和溶解，随后完全转移到100毫升容量瓶中，并用样品提取/稀释溶液调整体积。最终稀释比例约为1/20，具体取决于初始重量。取30–40毫升样品转移到50毫升Falcon管（Corning Science，墨西哥）中，在室温下以4500转/分钟离心10分钟。最后，将每种产品溶液1.5毫升转移到HPLC螺旋盖小瓶中。程序B（胶水和油漆）：将2.5克产品称重放入50毫升Falcon管中，记录准确重量，然后加入5.0毫升样品提取/稀释溶液。手动搅拌产品使其溶解，再加入5.0毫升样品提取/稀释溶液。溶液在4500转/分钟下离心30分钟。上清液转移到25毫升过滤离心管（0.45 μm PVDF滤膜，Thermo Scientific，美国）中，并在相同条件下离心30分钟，然后取1.5毫升转移到HPLC小瓶中。产品在室温下短暂存放后，从新打开的瓶子和容器中取样进行分析。样品提取物在分析前需冷藏并避光保存。本研究未包括打开容器后异噻唑啉酮的稳定性。

2.1.4 分析仪器系统
分析使用的是Agilent 1260 HPLC系统，配备二元泵、柱温箱和扫描紫外检测器（二极管阵列，DAD）。梯度洗脱条件为：流动相A：水95%，甲醇5%；流动相B：甲醇100%，两者均添加了4毫升/升的醋酸。梯度洗脱程序见表3。

2.2 贴片测试
2.2.1 贴片测试制剂
CMIT/MIT（0.215%水溶液，0.015% CMIT，0.2% MIT，CAS 55965–84-9）和BIT（0.1% pet，CAS 2634-33-5）的贴片测试制剂购自瑞典Vellinge的Chemotechnique Diagnostics公司。

2.2.2 测试对象
测试对象包括2022年1月1日至2023年12月31日期间因疑似过敏性接触性皮炎被转诊到瑞典哥德堡Sahlgrenska大学医院皮肤科和性病科的所有患者（表4）。所有患者都接受了包含BIT的CMIT/MIT测试，作为瑞典基线系列的一部分。

2.3 结果
研究结果证实了先前的报告，即瑞典西部皮炎患者中对BIT的敏感性正在增加。产品分析显示，在频繁且长时间接触皮肤的产品中，BIT的浓度可能比CMIT/MIT高几个数量级。年份
患者数量（n）
年龄（平均值±标准差）
男性（n%）
男性年龄（平均值±标准差）
女性（n%）
女性年龄（平均值±标准差）

2022年
387
45±19.0
121（31%）
47±19.7
266（69%）
45±18.7

2023年
416
44±17.5
117（28%）
43±16.5
299（72%）
44±17.9

总计
803
238
565

2.2.3 皮肤贴片测试程序
将制备好的样品放置在8×8毫米的IQ Ultra测试室中，这些测试室固定在低过敏性的外科胶带上（Chemotechnique Diagnostics，Vellinge，瑞典）。对于CMIT/MIT，使用的半抗原剂量为20微升；对于BIT，剂量为25毫克。测试室被贴在患者背部并保持封闭状态48小时。48小时后，患者自行取下贴片。皮肤贴片测试结果在第3天和第7天由经过培训的皮肤科医生和实验室技术人员进行读取。患者被要求报告任何在第二次测试后出现的迟发性反应。如果出现迟发性反应，患者将被安排进行额外的皮肤贴片测试。测试结果根据欧洲接触性皮炎学会（ESCD）的指南进行分类，阳性结果由皮肤科医生评估其临床意义[30]。

2.3 统计分析
使用精确二项式检验比较了CMIT/MIT和BIT的接触致敏总频率。使用Fisher精确检验比较了男性和女性对BIT的致敏频率。

2.4 伦理
该研究获得了哥德堡地区伦理委员会的批准，并按照《赫尔辛基宣言》中的伦理标准进行。参与者在参与研究前提供了书面同意书。

3 结果
3.1 分析方法
基于对两种不同类型产品的重复提取，提取程序的精确度相对标准偏差均小于10%（见第2.3节）。未进一步研究提取的有效性。在苯基取代柱上的色谱分析能够清晰地将异噻唑啉酮与基质干扰物分离，从而实现准确的定量（图1A,B）。此外，使用这两种提取方法，产品中的定量限（LOQ）远低于MIT（15 ppm）和BIT（500 ppm）的允许水平。MIT的LOQ范围为0.005–0.1 ppm（μg/g）。

3.2 化妆品和家用产品中的异噻唑啉酮浓度
分析显示，不同产品中的异噻唑啉酮含量差异很大（见图3）。在分析的14种产品中，9种含有MIT，9种含有BIT，6种同时含有MIT和BIT。在任何化妆品中均未检测到BIT。只有6种产品声明含有CMIT，其中只有3种的含量可测量（0.3 ppm）。所有结果均符合相关法规：MIT和CMIT的浓度在0.02–2.3 ppm范围内，BIT的浓度在3–270 ppm范围内（限值为500 ppm）。

3.3 对CMIT/MIT和BIT的致敏情况
共有803名患者（565名女性，238名男性）接受了皮肤贴片测试。对BIT的阳性反应率高于对CMIT/MIT的阳性反应率，分别为7.7%（62/803）和5.2%（42/803）（p=0.038）（表5）。表6展示了CMIT/MIT和BIT的阳性反应强度以及可疑反应和刺激性反应的分布。在对CMIT/MIT有反应的患者中，69%表现出强烈反应（+++），而对BIT有反应的患者中，13%表现出强烈反应。同时对CMIT/MIT和BIT有反应的患者仅有10名，占总测试人数的1.2%，或对至少一种CMIT/MIT有反应的患者的10.6%（图5A）。男性中对BIT的致敏率高于女性（9.7%，23/238 vs. 6.9%，39/565 vs. 6.5%，37/565），但男性中对BIT的致敏率并未显著更高（p=0.19，Fisher精确检验）（图5B,C）。

表5. 2022–2023年间，在萨尔格伦斯卡大学医院皮肤科和性病科连续接受测试的803名患者中对氯甲基异噻唑啉酮/甲基异噻唑啉酮（CMIT/MIT，0.215%水溶液）和/或苯基异噻唑啉酮（BIT，0.1%宠物用品）的阳性皮肤贴片反应率。

表6. 对CMIT/MIT（0.215%水溶液）和BIT（0.1%宠物用品）的阳性反应强度分布，以及对CMIT/MIT和BIT的可疑反应和刺激性反应分布。

图5. 2022–2023年间，在萨尔格伦斯卡大学医院皮肤科和性病科接受测试的所有患者中对氯甲基异噻唑啉酮/甲基异噻唑啉酮（CMIT/MIT，0.215%水溶液）（n=42）和苯基异噻唑啉酮（BIT，0.1%宠物用品）（n=62）的阳性皮肤贴片测试的维恩图（A）；以及男性和女性的阳性测试分布（B）。总测试患者数为803人（男性n=238，女性n=565）。

4 讨论
4.1 分析方法
许多实验室使用高端技术（UHPLC-MS(-MS）[29]，这些技术无疑适用于所研究的产品。然而，这里使用的传统HPLC设备配合紫外检测方法也能有效分析日常产品中的异噻唑啉酮含量，即使这些产品中的异噻唑啉酮含量低至允许水平的0.05%。能够使用一种通用方法高效处理多种类型的产品是一个优势。所研究的水基产品的组成、充足的样品量以及异噻唑啉酮的高浓度使其适合进行基本的提取、稀释和过滤操作。因此，可以使用基本的实验室设备。对于高粘度产品，需要使用过滤方法，这通常通过离心机完成，从而增加了样品制备的步骤。我们能够使用含45%甲醇的样品制备溶剂来处理所有分析的产品类型。MIT和CMIT的提取不需要有机溶剂，但提取和溶解BIT、OIT和DCOIT时需要有机溶剂。关键在于使用苯基取代柱，该柱对MIT的保留效果更好（见图2），从而获得清晰的峰形。相比之下，使用C18或类似取代相的柱子时，由于样品中甲醇含量高，MIT会在早期洗脱，导致峰形变宽，从而影响定量准确性。对于更疏水的异噻唑啉酮（如OIT和DCOIT），在C18柱上的保留时间较长，分析时间延长且溶剂消耗量增加。鉴于OIT和DCOIT等异噻唑啉酮的使用日益增多，能够同时高效地筛查多种异噻唑啉酮非常重要，当前方法正好满足了这一需求。

4.2 化妆品和家用产品中的异噻唑啉酮浓度
所有产品的异噻唑啉酮含量差异很大（见图3）。在分析的14种产品中，9种含有MIT，9种含有BIT，6种同时含有MIT和BIT。在任何化妆品中均未检测到BIT。只有6种产品声明含有CMIT，其中只有3种的含量可测量（0.3 ppm）。所有结果均符合相关法规：MIT和CMIT的浓度在0.02–2.3 ppm范围内，BIT的浓度在3–270 ppm范围内（限值为500 ppm）。

4.3 对CMIT/MIT和BIT的致敏情况
共有803名患者（565名女性，238名男性）接受了皮肤贴片测试。对BIT的阳性反应率高于对CMIT/MIT的阳性反应率，分别为7.7%（62/803）和5.2%（42/803）（p=0.038）（表5）。表6展示了CMIT/MIT和BIT的阳性反应强度以及可疑反应和刺激性反应的分布。在对CMIT/MIT有反应的患者中，69%表现出强烈反应（+++），而对BIT有反应的患者中，13%表现出强烈反应。同时对CMIT/MIT和BIT有反应的患者仅有10名，占总测试人数的1.2%，或对至少一种CMIT/MIT有反应的患者的10.6%（图5A）。男性中对BIT的致敏率高于女性（9.7%，23/238 vs. 6.9%，39/565 vs. 6.5%，37/565），但男性中对BIT的致敏率并未显著更高（p=0.19，Fisher精确检验）（图5B,C）。

图5. 2022–2023年间，在萨尔格伦斯卡大学医院皮肤科和性病科连续接受测试的所有患者中对氯甲基异噻唑啉酮/甲基异噻唑啉酮（CMIT/MIT，0.215%水溶液）和苯基异噻唑啉酮（BIT，0.1%宠物用品）的阳性皮肤贴片测试结果。

4.4 化妆品和家用产品中的异噻唑啉酮浓度
所有产品的MIT浓度均低于化妆品的法定限值15 ppm（见图3）。BIT的测量浓度差异较大，但未超过消费品中的限值（500 ppm）。2015年的一项研究分析了比利时市场上化妆品和消费品中的MCIT、MIT和BIT含量[31]。该研究发现化妆品中的MIT浓度高于本研究，而BIT仅存在于地板清洁产品中。尽管两项研究规模较小，但数据表明在洗涤剂等消费品中更常使用BIT。由于不同类型产品的法规不同，尤其是化妆品与消费品之间的差异，接触异噻唑啉酮的风险可能较高，尤其是当同时接触多种产品时。此外，由于这些产品中BIT的标签要求不强制，因此对于对BIT过敏的患者来说，很难评估BIT接触过敏的相关性及避免含有BIT的产品。

4.5 对BIT和CMIT/MIT的致敏情况
本研究中BIT的致敏率（表5）高于我们之前的研究结果（4.4%）。瑞典西部BIT的致敏率上升与最近发表的欧洲研究结果一致[4, 11]。然而，与之前的研究相比，CMIT/MIT的致敏率也有所上升（1.3%）。尽管我们之前的研究样本量较小（385名患者），但当前研究的结果表明CMIT/MIT的阳性反应率有所增加。这很可能是由于2021年更新的瑞典CMIT/MIT测试样品中MIT浓度增加所致。然而，由于接受贴片测试的男性样本量较少，难以分析性别之间的差异。虽然已经详细研究了CMIT/MIT的最佳混合比例和测试浓度[32, 33]，但尚未针对BIT进行类似研究。由于只有少数BIT病例表现出强烈反应，可能当前的测试浓度过低。由于难以获取或获取的产品中BIT含量的信息不准确，因此难以评估BIT反应的临床意义。应进一步研究BIT的最佳贴片测试浓度及其临床意义，目前使用的方法可以满足这一需求。大多数对BIT或CMIT/MIT过敏的病例并未表现出对其他异噻唑啉酮的并发反应（图5）。使用0.215%的CMIT/MIT进行的贴片测试仅检测到16%的BIT接触过敏病例。有研究表明MIT和BIT之间存在交叉反应[34]，但也有临床研究显示MIT和BIT的并发阳性反应结果相反[11]。当前研究的结果支持了这些临床研究的结果。尽管所有异噻唑啉酮具有共同的异噻唑啉酮环结构，但不同异噻唑啉酮衍生物的侧链结构差异显著，导致它们的化学性质和三维结构在免疫细胞眼中有很大差异。这也体现在溶解度和极性上的差异，给分析方法带来了挑战。伴随反应被认为是同时暴露的结果。如图3所示，BIT和MIT在许多情况下被检测到存在于同一产品中。尽管BIT的致敏作用比MIT弱，在小鼠的局部淋巴结试验中，BIT的EC3值为1.9%，而MIT为0.4% [34]，但这种差异似乎不足以解释家庭产品中允许存在的BIT高浓度，因为欧洲地区对BIT的致敏率正在上升。此外，产品可能会被错误标注，就像在患者调查中作为示例产品分析的业余油漆那样（见图4）。如果没有对业余油漆进行化学分析的结果，就无法向患者提供关于二级预防的建设性建议。

4.4 结论

斑贴试验结果证实了先前的报告，即瑞典西部皮炎患者对BIT的致敏率正在增加。我们开发了一种使用简单提取和检测方法的稳健分析方法，可以用来检测各种产品中的异噻唑啉酮含量。通过该方法的分析表明，在那些皮肤接触频繁且持续时间较长的产品中，BIT的浓度可能比CMIT/MIT高几个数量级。综合来看，现有针对消费品中BIT的监管措施并不能保护消费者免受BIT的致敏或过敏性接触性皮炎的侵害。

作者贡献

Anne Farbrot：概念化、方法论设计、初稿撰写、审阅和编辑。
Jakob Kentson：调查、初稿撰写、审阅和编辑、方法论设计。
Hatice Koca Akdeve：调查、撰写、审阅和编辑。
Anders Blom：调查、撰写、审阅和编辑。
Britt-Marie Ehn：调查、撰写、审阅和编辑。
Naida Babic Mulic：调查、撰写、审阅和编辑。
Firoozeh Amirbeagi：调查、数据整理、撰写、审阅和编辑。
Mikael Alsterholm：调查、撰写、审阅和编辑。
Lina Hagvall：概念化、方法论设计、可视化、撰写、审阅和编辑、初稿撰写、项目管理工作。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明

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