基于气相色谱-质谱法的植物化学分析及生物活性导向的分馏技术用于Psidium guineense茎提取物的研究：体外与计算机模拟方法探究其抗氧化、抗糖尿病和抗菌潜力

《Analytical Science Advances》：Gas Chromatography-Mass Spectrometry-Based Phytochemical Profiling and Bioactivity-Guided Fractionation of Psidium guineense Stem Extracts: In Vitro and In Silico Insights Into Antioxidant, Antidiabetic and Antibacterial Potentials

　　**摘要**

Psidium guineense（桃金娘科）传统上被用于多种药用目的，尽管其茎部的研究尚未充分展开。本研究首次对茎部提取物进行了综合的植物化学、药理学和计算评估，以阐明其抗氧化、抗糖尿病和抗菌潜力。粗甲醇提取物使用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和水进行分馏。初步的植物化学筛查确认了其中含有黄酮类、单宁、皂苷、甾体、生物碱、萜类和苷类化合物。总酚类和黄酮类含量分别使用Folin–Ciocalteu试剂和氯化铝比色法进行测定。抗氧化能力通过2,2-二苯基-1-吡啶基肼（DPPH）测定法评估，抗糖尿病潜力通过抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶来评估，抗菌活性则通过圆盘扩散法测定。对甲醇提取物进行的气相色谱-质谱（GC-MS）分析鉴定出了28种植物成分。在所有组分中，二氯甲烷组分（DPG）显示出最高的酚类（247.94 ± 15.38 mg没食子酸当量/g）和黄酮类（510.27 ± 16.71 mg槲皮素当量/g）含量，并具有优异的DPPH自由基清除能力（IC50 = 7.45 ± 0.87 μg/mL），其清除活性可与抗坏血酸相媲美。在酶抑制试验中，DPG表现出显著的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制效果（IC50分别为22.28 ± 0.97 μg/mL和25.00 ± 2.01 μg/mL），这些效果超过了相关物种叶片提取物的报道值。所有组分均对枯草芽孢杆菌（B. subtilis）表现出中等的选择性抗菌活性，抑制圈直径为7–16 mm。GC-MS分析还初步鉴定出具有抗氧化、抗糖尿病和抗菌活性的化合物，计算机模拟对接结果显示这些化合物具有很强的结合能力。这些发现为Psidium guineense茎部的传统用途提供了科学依据，并强调了其作为潜在生物活性化合物来源的价值，值得进一步分离和表征。

**1 引言**

全球代谢性疾病负担的不断增加，尤其是糖尿病，凸显了迫切需要更安全的治疗策略[1, 2]。预计到2045年，糖尿病患者将达到6.93亿人，其主要原因是餐后高血糖，目前临床上使用阿卡波糖（acarbose）等酶抑制剂进行管理[2]。然而，这些合成抑制剂常伴随胃肠道副作用，因此人们开始关注具有更好耐受性的植物来源替代品[3]。糖尿病还受到氧化应激的加剧，这会促进疾病进展并引发并发症，包括神经病变和心血管疾病[4]。虽然有合成抗氧化剂可用，但其长期安全性仍令人担忧，从而推动了天然抗氧化剂来源的探索[5]。同时，多重耐药细菌的出现削弱了传统抗生素的效果，形成了需要从多种来源发现新抗菌剂的公共卫生危机[6]。在这种情况下，植物具有独特优势，因为它们产生的次生代谢物混合物可以同时针对多种病理过程，包括高血糖、氧化损伤和微生物感染[7, 8]。植物药的治疗效果归因于多种次生代谢物，如酚类、黄酮类、生物碱、单宁和萜类，这些物质具有广泛的生物活性[9]。在丰富的药用植物多样性中，Psidium属（桃金娘科）尤为重要[10]。例如，Psidium guajava（番石榴）因其抗糖尿病、抗氧化和抗菌特性而被广泛研究[11]。Psidium guineense Swartz（桃金娘科），俗称野生番石榴或巴西番石榴，是一种原产于热带美洲的灌木或小树，分布范围从墨西哥延伸到中美洲，直至阿根廷北部和巴西[12-14]。该物种已被纳入其原产地及更广泛地区的传统医学体系。在巴西民间医学中，用其叶子制成的煎剂广泛用于治疗炎症性疾病，而根和树皮的制剂则用于治疗胃肠道疾病（如腹泻和溃疡）以及作为利尿剂[12, 15]。然而，现有文献存在一个关键局限性：尽管Psidium guineense具有重要的民族药理学价值，但所有研究都仅集中在其地上部分——特别是叶子和果实。据我们所知，尚未有对其茎部的综合植物化学和药理学评估。这是一个重要的空白，因为植物器官通常积累不同的次生代谢物谱型；茎部中的化合物在质量和数量上可能与叶子和果实中的不同。此外，茎部在果实收获时通常作为农业废弃物被丢弃[16, 17]，而对其的利用可以将这种未充分利用的生物质转化为有价值的药物发现资源。迄今为止，尚未对Psidium guineense茎部进行过综合的植物化学或药理学研究，其治疗潜力仍完全未知。为填补这一空白，本研究采用了综合实验和计算方法。首先使用极性逐渐增加的溶剂对Psidium guineense茎部提取物进行生物活性引导的分馏，随后进行植物化学分析（总酚类和黄酮类含量测定），并评估其抗氧化、抗糖尿病（α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制）和抗菌活性。通过GC-MS鉴定出活性组分中的单个成分，并通过分子对接和ADMET分析进一步研究关键化合物，以确定作用机制并评估其成药潜力。

**2 方法与材料**

**2.1 化学品和试剂**

所有使用的化学品和溶剂均为分析级。甲醇、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯和蒸馏水用于提取和分馏，购自Sigma-Aldrich（美国）。氯化铝、碳酸钠、Folin–Ciocalteu试剂、二甲基硫氧化物和DPPH购自Merck（德国）。参考标准品（包括没食子酸、槲皮素和抗坏血酸）也来自Merck。磷酸钠缓冲液和p-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷用于抗糖尿病实验。阿卡波糖作为α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制实验的参考药物，购自Square Pharmaceuticals Ltd.（达卡，孟加拉国）。所有微生物培养基（包括Mueller-Hinton琼脂、营养肉汤及相关材料）均购自HiMedia Laboratories（印度）。用于抗菌测试的参考抗生素卡那霉素和氟康唑购自Sigma-Aldrich。

**2.2 植物材料、提取和分馏**

2023年2月，在孟加拉国Cumilla区的Comilla Hill地区采集了Psidium guineense Sw.的茎部，地理坐标为北纬23°27′30.5″，东经91°40′45.2″（海拔约45米）。这些植物生长在山坡的混交落叶林中。分类鉴定由达卡Mirpur的孟加拉国国家植物标本馆专家完成，并存档了一份凭证标本（编号DACB 32766）以供将来参考。采集后，用流动自来水彻底清洗茎部以去除附着物，切成小块（约2–3厘米长），然后在室温（25°C–28°C）下阴干7天，并保持良好通风以防止真菌生长。干燥后的茎部用研磨机粉碎成粗粉，储存在避光的无氧容器中直至提取[18]。大约500克Psidium guineense茎部粉末浸入3升甲醇中。该混合物在室温下搅拌7天以促进化合物充分溶解于溶剂中。过滤后，用Whatman No. 1滤纸分离植物残渣，并在减压条件下蒸发甲醇以获得浓缩的棕色粘稠甲醇提取物（MPG）。部分粗提取物用于直接分析，其余部分采用改进的Kupchan方法进行分馏[19]。分馏过程中，使用极性逐渐增加的溶剂依次分离提取物，得到四个不同的组分：石油醚组分（PPG）、二氯甲烷组分（DPG）、乙酸乙酯组分（EPG）和水组分（WPG）。这种系统分馏方法使每种组分中的特定类型化合物富集，便于识别和表征其生物活性。

**2.3 植物化学和生物活性测定**

对所有提取物（MPG、PPG、DPG、EPG、WPG）进行了初步的植物化学筛查，包括黄酮类、生物碱、单宁、甾体、皂苷、蒽醌、苷类和鞣花单宁的标准定性测试[20]。生物碱通过Mayer试剂检测（产生奶油状沉淀）。黄酮类通过Shinoda试剂检测（在Mg/HCl作用下呈现粉红色至红色）。单宁通过氯化铁试剂检测（产生蓝黑色或绿黑色沉淀）。皂苷通过泡沫测试检测（产生持久泡沫）。甾体（红棕色界面）和萜类（黄色）通过Liebermann–Burchard测试检测。蒽醌通过Borntrager试剂检测（在氨溶液中呈现粉红色至紫色）。心脏苷类通过Keller–Kiliani测试检测（产生棕色环）。树脂通过乙酸酐-硫酸测试检测（呈现紫色至紫色）。鞣花单宁通过与HCl煮沸检测（产生红色沉淀）。结果分为强阳性（+++）、阳性（++）、阳性（+）或阴性（?），详见表1。

**表1. Psidium guineense茎部提取物的植物化学分析**

| 测试 | MPG | PPG | DPG | EPG | WPG |
|-----------------|-----------------|-----------------|-----------------|-----------------|
| 黄酮类 | ++ | + | ++ | ++ |
| 蒽醌 | +++ | + | +++ | ++ |
| 树脂 | +++ | ++ | +++ | +++ |
| 单宁 | +++ | + | +++ | +++ |
| 苦苷 | ? | ++ | ? | ? |
| 鞣花单宁 | ? | ? | ? | ? |
| 皂苷 | +++ | + | +++ | +++ |
| 甾体 | +++ | + | +++ | +++ |
| 生物碱 | + | ? | + | ? |

**注：**丰度等级：+++（高）、++（中等）、+（低）、?（无）。DPPH自由基清除能力根据标准程序进行评估[21]。提取物和抗坏血酸（6.25–400 μg/mL）的系列稀释液与0.1 mM甲醇DPPH溶液混合。在黑暗中孵育30分钟后，于517 nm处测量吸光度。清除百分比计算为([Acontrol ? Asample] / Acontrol) × 100。IC50值通过绘制抑制百分比与样品浓度的关系图获得。总酚类含量（TPC）使用Folin–Ciocalteu方法测定，以没食子酸为标准[22]。具体操作为：每种提取物（50–400 μg/mL）与2.5 mL稀释的Folin–Ciocalteu试剂混合，再加2 mL 7.5%碳酸钠。在25°C下黑暗中孵育20分钟后，于756 nm处测量吸光度。结果以mg没食子酸当量（GAE）/g表示。总黄酮类含量（TFC）使用氯化铝比色法测定，以槲皮素为标准[23]。每种提取物与2% AlCl3溶液反应，在黑暗中孵育60分钟后，于415 nm处测量吸光度。结果以mg槲皮素当量（QCE）/g表示。对于α-淀粉酶抑制实验，每种提取物与500 μL酶（0.5 mg/mL，pH 6.8）预孵育10分钟[24]，然后加入500 μL 1%淀粉溶液继续孵育。反应结束后加入1 mL DNSA试剂并煮沸5分钟。稀释后用10 mL蒸馏水稀释，于540 nm处测量吸光度。对于α-葡萄糖苷酶抑制实验，每种提取物与100 μL酶溶液（0.5 U/mL，pH 6.8）预孵育10分钟[25]，然后加入50 μL 5 mM p-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷继续孵育30分钟。反应结束后加入100 μL 0.1 M Na2CO3终止。所有实验重复三次，并计算IC50值。抗菌活性通过圆盘扩散法针对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、伤寒沙门氏菌和黑曲霉进行评估。无菌8毫米圆盘浸渍10 μL提取物（500 μg/圆盘）或参考抗生素（细菌用卡那霉素30 μg/圆盘；真菌用氟康唑30 μg/圆盘）。平板在35°C下孵育24小时（细菌）或27°C下孵育24小时（真菌），测量抑制圈并与对照组比较[26]。甲醇提取物的GC-MS分析使用Shimadzu GCMS-QP2020系统进行，柱子为DB-5MS（30 m × 0.25 mm内径），固定相为5%二苯基和95%二甲基聚硅氧烷，载气为氦气。以220°C、220°C/min的速率升温至150°C，然后以5°C/min的速率升温至280°C。离子化方式为电子撞击，质量谱扫描范围为40–650 m/z，扫描速度为0.30 s/次。化合物通过将质谱与NIST库（2008–2014）进行比较进行初步鉴定，未使用真实参考标准或不同极性柱子的保留指数进行确认。尽管应用了≥85%的相似性阈值以提高置信度，但为了确定结构归属，仍需要使用标准共注射、保留指数计算或补充光谱方法等额外验证技术。

2.4 计算分析

基于相对丰度和科学文献中记录的生物活性，选择了六种通过GC-MS鉴定出的主要化合物进行分子对接。这些化合物是：stigmastan-3-ol 5-氯代醋酸盐（C1）、十二烷酸（C2）、11-巯基十一烷酸（C3）、角鲨烯（C4）、1R,2C,3T,4T-四甲基环己烷（C5）和缩水甘油棕榈酸酯（C6）（图1）。它们的3D结构是从PubChem获得的，并使用Gaussian 09 W和B3LYP/6-31G+(d,p)基组进行了最小化处理。图1：在图形查看器中打开

图1：从P. guineense茎中选出的六种主要化合物的化学结构，用于分子对接。化合物：C1（stigmastan-3-ol 5-氯代醋酸盐）、C2（十二烷酸）、C3（11-巯基十一烷酸）、C4（角鲨烯）、C5（1R,2C,3T,4T-四甲基环己烷）和C6（缩水甘油棕榈酸酯）。每个结构的PubChem CID均已提供。目标蛋白质的晶体结构是从RCSB蛋白质数据库中获得的：人类谷胱甘肽过氧化物酶2（2HE3）用于DPPH自由基清除能力，人类胰腺α-淀粉酶（4GQR）和人类溶酶体α-葡萄糖苷酶（5NN5）用于抗糖尿病活性，以及来自B. subtilis（1LNZ）和S. typhimurium（1TM2）的细菌蛋白质用于抗菌活性。蛋白质通过去除水分子并与配体共结晶来制备，然后进行能量最小化。分子对接是使用PyRx（v0.8）中的AutoDock Vina进行的。网格框以活性位点为中心，并针对每种蛋白质优化了尺寸。具体的网格框尺寸（x, y, z以埃为单位）分别为：2HE3为38.75 × 46.25 × 46.93；4GQR为58.99 × 78.20 × 58.54；5NN5为82.95 × 79.57 × 80.19；1LNZ为56.92 × 110.48 × 45.00；1TM2为39.55 × 45.83 × 63.21。对接姿势按照结合亲和力（kcal/mol）进行排序，使用BIOVIA Discovery Studio可视化顶部姿势以识别氢键、疏水相互作用和其他非共价接触。ADMET属性是使用admetSAR在线服务器预测的。生物活性谱是使用Prediction of Activity Spectra for Substances（PASS）工具[27]预测的。药物相似性是使用SwissADME网络服务器根据Lipinski、Ghose、Veber、Egan和Muegge过滤器进行评估的，并相应计算了生物利用度分数[28, 29]。关键物理化学参数包括分子量（MW，以道尔顿为单位）、Wildman–Crippen logP（WLOGP，一种片段脂溶性估计）、带有校正的原子加和logP（XLOGP3，另一种脂溶性预测器）、摩尔折射率（MR，以cm3/mol为单位，反映分子体积和极化性）以及可旋转键的数量（rotors，表示分子灵活性）。生物利用度分数预测了大鼠口服生物利用度≥10%的概率。尽管可能存在口服吸收减少的情况，但违反多个规则的化合物仍可能具有治疗潜力。

2.5 统计评估

所有涉及定量测量的测试都进行了三次，结果表示为平均值±标准差（SD）。组间差异使用单因素ANOVA进行评估，统计显著性设定为p < 0.01。统计处理使用SPSS（版本29.0）进行，而图表使用GraphPad Prism（版本6.0）生成。

3 结果与讨论

3.1 植物化学分析和GC-MS分析

对P. guineense茎提取物的初步植物化学筛选确认了多种次生代谢物的存在，包括黄酮类、单宁、皂苷、甾醇、生物碱和蒽醌（表1）。黄酮类和单宁在所有组分中都一致存在，而生物碱集中在甲醇（MPG）、二氯甲烷（DPG）和乙酸乙酯（EPG）组分中，但在非极性石油醚（PPG）和高极性水（WPG）组分中不存在。这种分布模式反映了生物碱在中等极性溶剂中的不同溶解度[20]。苷类仅在PPG和WPG组分中被检测到，表明它们倾向于在非极性或高极性环境中提取。这些发现与之前关于Psidium物种的报告一致，其中叶提取物显示了类似的植物化学多样性[30, 31]。然而，本研究首次提供了针对茎部的具体代谢物谱型，表明可能存在器官特异性的代谢物积累。定量分析显示不同组分中的总多酚含量（TPC）和总黄酮含量（TFC）存在显著差异（表2和图2）。二氯甲烷组分（DPG）显示出最高的酚类含量（247.94 ± 15.38 mg GAE/g）和黄酮类含量（510.27 ± 16.71 mg QCE/g），其次是EPG、MPG、WPG和PPG（见表S1和S2，图S1–S4）。这种基于极性的明显梯度表明，中等极性溶剂（二氯甲烷、乙酸乙酯）在从茎基质中提取酚类和黄酮类化合物方面最为有效。DPG组分获得的TPC值显著高于之前报道的P. guineense叶提取物的值（54.34 ± 0.49 mg GAE/g）[32]，并且与其他药用重要的Psidium物种的值相当或更高[33, 34]。这一发现特别重要，因为它表明通常作为农业废弃物的茎部可能含有比更常研究的叶子更丰富的酚类物质。DPG中的高多酚负荷为后续实验观察到的生物活性提供了强有力的化学基础，这与酚类作为主要抗氧化剂和酶抑制剂的作用是一致的[21]。

表2. P. guineense茎提取物的植物化学成分和生物活性谱型。

DPPH（IC50）
μg/mL
TPC（mg/g）相当于GA
TFC（mg/g）相当于QC
α-淀粉酶 IC50（μg/mL）
α-葡萄糖苷酶 IC50（μg/mL）

MPG
16.85 ± 1.29
149.29 ± 17.87
410.97 ± 8.23
46.77 ± 1.22
85.10 ± 2.00

PPG
26.48 ± 1.51
53.49 ± 13.32
116.90 ± 8.99
125.89 ± 1.09
102.00 ± 2.00

DPG
7.45 ± 0.87
247.94 ± 15.38
510.27 ± 16.71
22.28 ± 0.97
25.00 ± 2.01

EPG
11.31 ± 1.26
159.54 ± 15.27
441.84 ± 10.46
31.62 ± 1.08
59.33 ± 4.04

WPG
21.35 ± 1.26
135.45 ± 10.60
313.89 ± 12.19
43.65 ± 1.25
65.33 ± 2.52

注：数据为平均值 ± 标准差，n = 3；*p < 0.01表示组间差异显著。图2：在图形查看器中打开

P. guineense茎提取物的植物化学谱型和抗氧化活性。(A) 以IC50值（μg/mL）表示的DPPH自由基清除活性，与抗坏血酸相比。(B) 总酚类含量（mg GAE/g）。(C) 总黄酮类含量（mg QCE/g）。数据代表平均值 ± 标准差（n = 3）。*p < 0.01表示组间比较。对P. guineense甲醇提取物的GC-MS谱型分析显示了复杂的化学谱型，色谱图中检测到28个峰（表3）。然而，由于植物基质的复杂性，一些峰可能代表共洗脱的化合物而不是单一的纯成分。因此，这28个峰应被视为色谱特征，每个峰可能包含一种或多种植物成分（见图S5）。在质量光谱反卷积允许合理分离共洗脱信号的情况下，对每个峰内的主要成分进行了初步化合物鉴定。洗脱模式显示出相当大的多样性，保留时间从3.188分钟（1,3-oxathiane, 5-tert-butyl-）到38.421分钟（stigmastan-3-ol, 5-chloro-, acetate, 3β,5α）不等。在所有初步鉴定的化合物中，stigmastan-3-ol 5-氯代醋酸盐显示出最高的相对丰度，占总峰面积的13.25%，尽管GC-MS峰面积反映的是检测器响应，而不是绝对浓度（见表S3）。其作为氯化化合物的身份提出了提取伪影的可能性，因为氯化天然产物在植物中并不常见。这种氯化stigmastanol衍生物与相关物种如P. guajava的典型叶谱型形成对比，后者主要由倍半萜、石竹烯氧化物和黄酮苷元组成[35]。其他鉴定的化合物包括十二烷酸（10.89%）、11-巯基十一烷酸（10.65%）、角鲨烯（7.34%）和缩水甘油棕榈酸酯（3.90%），所有这些在文献中都具有已建立的抗菌和抗氧化特性[36, 37]。因此，GC-MS谱型确认了从氧化杂环到甾醇衍生物的结构多样的生物活性成分的存在，表明这些化合物可能共同贡献了P. guineense茎观察到的药理特性。这种化学基础，加上DPG中的高多酚负荷，为后续实验观察到的生物活性提供了强有力的基础，这与酚类作为主要抗氧化剂和酶抑制剂的作用是一致的[21]。

表3. 通过GC-MS分析对P. guineense甲醇茎提取物中主要化合物的初步鉴定。峰号 保留时间
面积（%）
化合物名称
分子式
分子量

1
3.188
0.02
1,3-Oxathiane, 5-tert-butyl-
CH16OS
160

2
3.620
2.10
苯, 1,3-二甲基-
C8H10
106

10
15.090
0.88
5-羟甲基呋喃
C6H6O3
126

16
24.240
0.66
新植二烯
C20H38
278

20
28.182
10.89
十二烷酸
C12H24O2
200

21
30.570
4.29
1r,2c,3t,4t-四甲基环己烷
C10H20
140

25
31.803
10.65
11-巯基十一烷酸
C11H22O2S
218

26
34.726
3.90
缩水甘油棕榈酸酯
C19H36O3
312

27
37.844
7.34
角鲨烯
C30H50
410

28
38.421
13.25
stigmastan-3-ol 5-氯代醋酸盐 (3β,5α)
C31H53ClO2
492

注：仅显示面积≥0.66%（主要峰，>总面积的50%）的化合物；次要峰被省略。粗体 = 选中进行对接（丰度>3%，有记录的生物活性）。NIST库的初步鉴定相似性≥85%；排除较低匹配。

3.2 抗氧化活性和分子对接

所有提取物都表现出浓度依赖的DPPH自由基清除活性，抗坏血酸（IC50 = 5.04 ± 0.55 μg/mL）作为阳性对照（表2）。DPG组分在植物提取物中表现出最强的活性（IC50 = 7.45 ± 0.87 μg/mL），其次是EPG（11.31 ± 1.26 μg/mL）、MPG（16.85 ± 1.29 μg/mL）、WPG（21.35 ± 1.26 μg/mL）和PPG（26.48 ± 1.51 μg/mL），如表S4和图S6所示。DPG的优异活性直接与其高酚类和黄酮类含量相关，这与这些化合物已建立的供氢和稳定自由基的能力一致[27]。DPG的IC50值与抗坏血酸的值非常接近，并超过了相关物种叶提取物报告的值，后者通常在15–30 μg/mL之间[35, 36]。这表明P. guineense茎，特别是其可溶于二氯甲烷的成分，是一个非常有前途的天然抗氧化剂来源。为了建立这种活性的机制基础，进行了针对人类谷胱甘肽过氧化物酶2（GPX2，PDB: 2HE3）的分子对接，GPX2是细胞抗氧化防御中的关键酶。对接GPX2是为了探索与内源性抗氧化防御酶的潜在相互作用，而不是直接模拟DPPH清除。在GC-MS鉴定的六种主要化合物中（表4），角鲨烯（C4）表现出最强的结合亲和力（-6.8 kcal/mol），与VAL21、VAL62形成稳定的烷基相互作用，并与PHE26形成π-烷基接触（见图S7和S8）。这种强烈的相互作用值得注意，因为角鲨烯是一种公认的内源性抗氧化剂，其在提取物中的高丰度（占总峰面积的7.34%）为观察到的自由基清除活性提供了潜在的机制联系[38]。此外，十二烷酸（C2）与关键活性位点残基LEU101（1.95 ?）、LEU16（2.57 ?）和ASP17（2.35 ?）形成了三个常规的氢键（见表S5），进一步支持了脂肪酸衍生物在氧化还原调节中的作用，这一现象也得到了其他植物油研究的证实[39]。这些计算发现与体外观察结果一致，并确定了特定化合物作为P. guineense茎抗氧化潜力的潜在贡献者。

3.3 抗糖尿病活性和酶抑制

通过抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶来评估提取物的抗糖尿病潜力，这两种酶是餐后高血糖管理的关键靶点[40]。对于α-淀粉酶抑制（图3），DPG再次表现出最强的活性（IC50 = 22.28 ± 0.97 μg/mL），其次是acarbose（13.13 ± 0.89 μg/mL），其次是EPG（31.62 ± 1.08 μg/mL）、WPG（43.65 ± 1.25 μg/mL）和PPG（46.77 ± 1.22 μg/mL）（见图S9和表S6）。DPG在两种酶靶点上的持续优越性强烈表明，这种组分中集中的中等极性酚类和黄酮类成分是主要活性剂。这些IC50值与P. guajava叶提取物报告的值（α-淀粉酶为20–50 μg/mL）相当[25]，突显了茎部之前未被充分认识的价值。体外酶抑制试验存在固有的局限性：它们使用的是优化后的条件，无法模拟胃肠道环境，而且由于代谢、蛋白质结合和生物利用度的因素，药效并不能预测体内的实际效果。尽管该提取物的表现与已报道的番石榴叶提取物的数值相当[25]，但此类比较仍需谨慎对待。这些发现为通过动物模型研究来评估其真正的抗糖尿病潜力提供了依据。

图3：通过酶抑制作用展示的P. guineense茎提取物的抗糖尿病活性。(A) α-淀粉酶IC50值（μg/mL）。(B) α-葡萄糖苷酶IC50值（μg/mL）。阿卡波糖被用作标准抑制剂。数据表示平均值±标准差（n = 3）。*p < 0.01，表示组间差异显著。通过与人类胰腺α-淀粉酶（4GQR）和人类溶酶体α-葡萄糖苷酶（5NN5）的分子对接，提供了机制上的验证（表4）。化合物C1是一种stigmastan-3-醇衍生物，也是提取物中含量最丰富的成分（占总峰面积的13.25%），它对α-淀粉酶（?9.0 kcal/mol）和α-葡萄糖苷酶（?7.2 kcal/mol）的结合亲和力最强（见图S11–S14，表S8和S9）。其预测的结合模式通过包括与α-葡萄糖苷酶中的TYR360的氢键相互作用而得到稳定，该残基也参与阿卡波糖的结合[41]。这一计算结果提示了一种可能的竞争性抑制机制，类似于阿卡波糖的作用机制，尽管需要通过实验验证（例如酶动力学研究）来确认这一作用机制。对接结果与体外酶抑制数据完全一致，表明C1是优先分离和实验验证的对象，为P. guineense茎的抗糖尿病潜力提供了合理的机制解释。

3.4 抗菌活性和计算验证

抗菌测试显示，这些提取物对测试的菌株具有选择性活性（见图4）。所有提取物在500 μg/disc浓度下对大肠杆菌（E. coli）和阿尼巴菌（A. niger）均无活性。然而，它们对枯草芽孢杆菌（B. subtilis，革兰氏阳性）和伤寒沙门氏菌（S. typhi，革兰氏阴性）表现出活性。在枯草芽孢杆菌中，DPG产生了最大的抑制圈（16 mm），其次是WPG（14 mm）、MPG（13 mm）和PPG/EPG（各7 mm）。在伤寒沙门氏菌中，DPG再次显示出最高的活性（13 mm），其次是WPG（12 mm）。卡那霉素（30 μg/disc）在枯草芽孢杆菌中产生了22 mm的抑制圈，在伤寒沙门氏菌中产生了21 mm的抑制圈，而氟康唑在阿尼巴菌中产生了12 mm的抑制圈（表5）。对革兰氏阳性菌株枯草芽孢杆菌的优先活性与这些细菌对酚类化合物的已知敏感性一致，因为酚类化合物更容易穿透较简单的革兰氏阳性细胞壁[42]。对革兰氏阴性菌株伤寒沙门氏菌的中等活性表明，某些成分可能还针对了膜破坏以外的机制。这种选择性模式与一些番石榴叶提取物报告的广谱活性不同[13, 43]，可能反映了茎部独特的植物化学成分。

3.4 抗菌活性和计算验证

抗菌测试显示，这些提取物对测试的菌株具有选择性活性（见图4）。所有提取物在500 μg/disc浓度下对大肠杆菌（E. coli）和阿尼巴菌（A. niger）均无活性。然而，它们对枯草芽孢杆菌（B. subtilis，革兰氏阳性）和伤寒沙门氏菌（S. typhi，革兰氏阴性）表现出活性。在枯草芽孢杆菌中，DPG产生了最大的抑制圈（16 mm），其次是WPG（14 mm）、MPG（13 mm）和PPG/EPG（各7 mm）。在伤寒沙门氏菌中，DPG再次显示出最高的活性（13 mm），其次是WPG（12 mm）。卡那霉素（30 μg/disc）在枯草芽孢杆菌中产生了22 mm的抑制圈，在伤寒沙门氏菌中产生了21 mm的抑制圈，而氟康唑在阿尼巴菌中产生了12 mm的抑制圈（表5）。对革兰氏阳性菌株枯草芽孢杆菌的优先活性与这些细菌对酚类化合物的已知敏感性一致，因为酚类化合物更容易穿透较简单的革兰氏阳性细胞壁[42]。对革兰氏阴性菌株伤寒沙门氏菌的中等活性表明，某些成分可能还针对了膜破坏以外的机制。这种选择性模式与一些番石榴叶提取物报告的广谱活性不同[13, 43]，可能反映了茎部独特的植物化学成分。

分子对接针对细菌靶点提供了机制上的见解（表4）。对于枯草芽孢杆菌（SPO0B相关GTP结合蛋白Obg，PDB: 1LNZ），C1再次显示出最强的结合亲和力（?6.9 kcal/mol），与ARG252、LEU249和PHE166形成了烷基和π-烷基相互作用。C6、C3和C2与活性位点残基（包括SER168、LEU249、GLU250和GLY251）形成了氢键（见图S15和S16，表S10）。对于伤寒沙门氏菌（LsrB AI-2受体，PDB: 1TM2），C1显示出最高的亲和力（?8.8 kcal/mol），并形成了广泛的烷基和π-烷基接触。C6与GLN167形成了关键的氢键（2.01 ?），而C2和C3都与ALA222形成了氢键（见图S17和S18，表S11）。这些靶点参与了细菌应激适应（枯草芽孢杆菌）和群体感应（伤寒沙门氏菌）过程，这些过程间接关系到细菌的存活和毒力[44]。因此，计算证据指向特定的、基于靶点的机制，而非非特异性的膜破坏，这解释了尽管抑制圈中等但仍观察到的选择性抗菌效果。为了评估这些初步鉴定化合物的治疗潜力，进行了PASS预测和药物相似性分析（表6）。PASS分析预测了广泛的活性，包括抗氧化（Pa 0.152-0.657）、抗炎（C5: 0.713）、抗菌（C4: 0.397）和保肝（C1: 0.667）效果，扩展了P. guineense的潜在治疗应用范围（见表S12）。药物相似性评估显示，化合物C2（十二烷酸）和C3（十一烷酸，11-巯基-）表现出优异的预测口服生物利用度，符合所有Lipinski、Ghose、Veber、Egan和Muegge规则，生物利用度得分为0.85（见表S13[45]）。相比之下，具有较高预测结合亲和力的对接候选物（C1、C4、C5和C6）违反了多个参数，导致生物利用度得分较低（0.55）。这突显了天然产物药物发现中的一个常见挑战：具有强靶点亲和力的化合物可能需要结构修饰以优化药代动力学特性。这也强调了整个提取物或标准化组分（DPG）的价值，其中像C1（高亲和力）和C2（高生物利用度）这样的化合物组合可能提供有效的治疗复合物，平衡药效和吸收。

表6：P. guineense茎提取物的抗菌效果，以毫米为单位的抑制圈。提取物/标准品

| 组分 | 抑制圈（mm） |
|-----------------|---------|
| 大肠杆菌（E. coli） | （?ve） |
| 伤寒沙门氏菌（S. typhi） | （?ve） |
| 枯草芽孢杆菌（B. subtilis） | （+ve） |
| 阿尼巴菌（A. niger） | |
| 空白 | |
| 氟康唑（30 μg/disc） | |
| 卡那霉素（30 μg/disc） | |
| MPG（500 μg/disc） | |
| PPG（500 μg/disc） | |
| DPG（500 μg/disc） | |
| EPG（500 μg/disc） | |
| WPG（500 μg/disc） | |

分子对接针对细菌靶点提供了机制上的见解（表4）。对于枯草芽孢杆菌（SPO0B相关GTP结合蛋白Obg，PDB: 1LNZ），C1再次显示出最强的结合亲和力（?6.9 kcal/mol），与ARG252、LEU249和PHE166形成了烷基和π-烷基相互作用。C6、C3和C2与活性位点残基（包括SER168、LEU249、GLU250和GLY251）形成了氢键（见图S15和S16，表S10）。对于伤寒沙门氏菌（LsrB AI-2受体，PDB: 1TM2），C1显示出最高的亲和力（?8.8 kcal/mol），并形成了广泛的烷基和π-烷基接触。C6与GLN167形成了关键的氢键（2.01 ?），而C2和C3都与ALA222形成了氢键（见图S17和S18，表S11）。这些靶点参与了细菌应激适应（枯草芽孢杆菌）和群体感应（伤寒沙门氏菌）过程，这些过程间接关系到细菌的存活和毒力[44]。因此，计算证据指向特定的、基于靶点的机制，而非非特异性的膜破坏，解释了尽管抑制圈中等但仍观察到的选择性抗菌效果。为了评估这些初步鉴定化合物的治疗潜力，进行了PASS预测和药物相似性分析（表6）。PASS分析预测了广泛的活性，包括抗氧化（Pa 0.152-0.657）、抗炎（C5: 0.713）、抗菌（C4: 0.397）和保肝（C1: 0.667）效果，扩展了P. guineense的潜在治疗应用范围（见表S12）。药物相似性评估显示，化合物C2（十二烷酸）和C3（十一烷酸，11-巯基-）表现出优异的预测口服生物利用度，符合所有Lipinski、Ghose、Veber、Egan和Muegge规则，生物利用度得分为0.85（见表S13[45]）。相比之下，具有较高预测结合亲和力的对接候选物（C1、C4、C5和C6）违反了多个参数，导致生物利用度得分较低（0.55）。这突显了天然产物药物发现中的一个共同挑战：具有强靶点亲和力的化合物可能需要结构修饰以优化药代动力学特性。这也强调了整个提取物或标准化组分（DPG）的价值，其中像C1（高亲和力）和C2（高生物利用度）这样的化合物组合可能提供有效的治疗复合物，平衡药效和吸收。

4 结论

这项综合研究提供了初步证据，支持P. guineense茎的传统用途，表明它可能是值得进一步研究的生物活性化合物的来源。系统的溶剂分级证明至关重要，发现二氯甲烷可溶性组分（DPG）具有最高的药理活性，这与其中高含量的酚类和黄酮类化合物相关。提取物显著的自由基清除和还原能力，以及对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的强体外抑制作用，为其在管理氧化应激和糖尿病中的传统用途提供了证据。其抗高血糖潜力尤为显著，DPG组分表现出的酶抑制活性与关于广泛研究的番石榴叶的报道相当。此外，对枯草芽孢杆菌的选择性抗菌活性，以及通过GC-MS鉴定出的28种植物成分和与关键细菌酶的计算机对接结果，强调了这种植物材料的多靶点治疗能力。计算分析初步鉴定出stigmastanol衍生物（C1）和角鲨烯（C4）作为感兴趣的化合物，基于它们对糖尿病和抗氧化靶点的预测结合亲和力。然而，这些化合物的身份需要通过分离和光谱表征（如NMR）来确认，它们对生物活性的贡献需要使用纯化化合物进行实验验证。预测的ADMET和药物相似性分析为药物发现提供了进一步研究的潜力，特别是十二烷酸（C2）表现出优异的生物利用度。然而，这项研究的体外性质是一个重大限制，其发现应被视为初步证据，而非治疗效力的决定性证明。观察到的生物活性和计算预测需要通过体内研究来验证，以评估真正的药理潜力、生物利用度、代谢和毒性。此外，负责观察到的活性的具体化合物仍需通过生物测定指导的分级进行分离和表征，然后确认它们的单独和协同效应。总之，这项工作成功地将P. guineense茎从一个未被充分探索的农业副产品转变为经过验证的多靶点生物活性剂的来源。这些发现为其传统应用提供了初步支持，并强调了进一步研究的必要性。未来的研究应旨在通过生物测定指导分离和表征特定化合物，特别是Stigmastanol，以确认它们的单独生物活性和机制，随后进行临床前体内研究以评估安全性和有效性。这项研究为开发基于P. guineense茎的标准化植物药或营养保健品提供了坚实的基础，有助于从自然生物多样性中可持续地发现药物。

作者贡献

Md. Jahid Hossain：监督、调查、正式分析、概念化、项目管理、撰写——原始草稿。Mst. Shagorika Shila：撰写——审阅和编辑、撰写——原始草稿、验证、正式分析、可视化、方法学。Muhammad Rashedul Islam：调查、概念化。Jakir Ahmed Chowdhury：概念化。

致谢

作者衷心感谢孟加拉国东西大学的药学系提供的研究设施和后勤支持。生成式AI工具仅用于提高语言表达和可读性。所有内容随后由作者进行了审阅和编辑，作者对最终版本负全责。

伦理声明

作者没有需要报告的内容。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明

本研究生成和分析的所有相关数据均包含在本文及其支持信息文件中。支持信息包含详细的对接相互作用表、原始GC-MS色谱图和所有蛋白质-配体复合物的2D相互作用图。质谱数据和分子对接输出文件（PDBQT格式）可根据合理请求向相应作者索取。