掺铈的MnCoO?纳米花用于赭曲霉毒素A的无标记比色传感

《Microchemical Journal》：Ce-doped MnCoO x nanoflower for label-free colorimetric sensing of ochratoxin A

纳米酶检测技术研究中，通过Ce掺杂调控MnCoO_x的氧空位密度和表面电荷，显著提升其氧化酶活性及aptamer负载效率，构建了0.03nM超低检测限的便携式智能手机生物传感器，实现OTA现场快速筛查。

　　

侯丹|周慧欣|刘思琪|方欣瑜|吴东平|廖晓宁

江西省农业大学霉菌毒素研究中心，南昌 330045，中国

摘要

基于锰的纳米酶因其低成本、无毒性以及多种类似天然酶的活性而受到广泛关注。然而，活性位点的密度低和表面负电荷限制了它们在比色适配体传感器中的应用。本文制备了一种类氧化酶的三金属纳米酶——掺铈的MnCoO_x（MnCoCeO_x）。通过引入少量的Ce^3+/4+，在复合材料中产生了大量的氧空位，从而显著增强了纳米酶的活性。此外，Ce掺杂使MnCoO_x的表面电位从负变为正，有效提高了适配体的负载效率，进而增强了其对赭曲霉毒素A（OTA）的特异性识别能力。此外，通过适配体与目标分子的结合事件，可以可逆地调节MnCoCeO_x纳米酶的活性，从而实现OTA的比色检测。在优化条件下，该比色生物传感器在0.1–100?nM的浓度范围内表现出宽线性检测范围，最低检测限为0.03?nM。此外，还开发了一种基于智能手机的便携式检测器，结合MnCoCeO_x纳米酶用于液体比色分析，能够高灵敏度和准确地检测OTA，显示出其在食品中霉菌毒素残留物原位检测方面的巨大潜力。

引言

霉菌毒素污染对食品安全构成了严重的全球性挑战，由于其致癌、免疫抑制和神经毒性作用，对人类和动物健康有着深远影响[1]。赭曲霉毒素A（OTA）是最有毒的霉菌毒素之一，由曲霉菌和青霉菌产生[2]，尤其令人担忧，因为它经常出现在储存不当的农产品中，如面粉、玉米、大米和谷物及其副产品中。传统的OTA检测方法包括高效液相色谱、色谱-质谱和表面等离子体共振[3]。然而，这些方法需要昂贵的精密仪器、复杂的操作程序和耗时的预处理过程，阻碍了它们的现场应用。因此，迫切需要开发简单且成本效益高的OTA现场检测方法，特别是在偏远地区。

无标记策略的纳米酶技术是构建比色生物传感器最有效和最有前景的方法之一，因为它易于制备、灵敏度高且无需显色剂[4]、[5]、[6]。具有过氧化物酶样和氧化酶样活性的纳米酶在比色传感器中得到了广泛应用[7]。与过氧化物酶样纳米酶相比，氧化酶样纳米酶可以在氧气存在下直接催化底物，无需使用有害物质如过氧化氢[9]、[10]，因此使用氧化酶样纳米酶构建基于无标记策略的比色传感平台来检测OTA具有很大潜力[11]。在各种类型的纳米酶中，金属氧化物在比色传感器中表现优异，因为它们具有结构多样性、可控的催化位点、表面可修饰性和低成本[12]。特别是基于锰的氧化物，包括MnO₂ [13]、[14]、[15]、Mn₂O₃ [16]、Mn₃O₄ [17]、MnCo₂O₄ [18] 和 MnFeO [20]，已在比色平台中得到广泛研究。然而，与天然酶相比，锰氧化物纳米酶通常具有较低的活性位点密度[21]和有限的特异性识别能力[22]，这大大限制了它们在比色生物传感器中的应用，因为灵敏度仍然较低[23]。因此，获得具有高氧化酶样活性的基于锰的纳米酶用于比色应用仍然是一个重大挑战。

氧空位（OVs）是氧化酶模拟效应的主要原因[8]，并且有利于O₂的吸收和激活，生成更具反应性的O₂^●?自由基[19]。在这种情况下，添加各种添加剂被认为可以有效增加金属氧化物中的氧空位数量及其氧化酶样活性[25]。在各种掺杂材料中，铈（CeO₂）表现出出色的储氧能力、良好的氧化还原活性和优异的热稳定性[26]、[27]。Ce³⁺和Ce⁴⁺之间的有效转换以及CeO₂掺杂产生的大量氧空位活性位点显著促进了电荷转移和高度反应性物种（O₂^2?/O^?）的生成/传输[28]。在相关研究中，李等人证明CeO₂Mn_1.08O_x的纳米酶活性比MnO₂更强[29]。李进一步证实，CeO₂在异质界面诱导了晶体缺陷，从而产生了大量可用作活性位点的氧空位。

识别机制是比色传感器设计中的另一个重要问题，以减少假阳性[30]。适配体作为一种生物识别元件，由于其良好的化学稳定性、高特异性、高生物相容性和易于合成，已成为无标记生物传感器的理想选择[31]、[32]。最近的相关研究表明，带负电荷的适配体可以通过静电相互作用吸附在带正电荷的纳米酶表面[33]，这种物理吸附机制可作为基于纳米酶的比色生物传感的替代方法[34]、[35]。具体来说，适配体在纳米材料上的高负载效率可以显著提高目标识别能力和传感信号[36]。然而，锰氧化物本身的负表面电荷[37]、[38]限制了高适配体负载密度的实现，降低了比色传感器的检测灵敏度。因此，同时增强基于锰的纳米材料的催化性能和正表面电荷至关重要。

受上述工作的启发，本文通过Mn-Co-Ce混合薄片的自组装制备了掺铈的MnCoO_x纳米花。其中，少量CeO₂的引入不仅在复合材料中产生了大量氧空位，还带来了更正的表面电位，从而显著增强了类氧化酶活性并提高了适配体的负载效率。在这个传感系统中，OTA-适配体被用作OTA识别元件，MnCoCeO_x用作信号生成元件。如图1所示，OTA-适配体的修饰抑制了MnCoCeO_x的类氧化酶活性，因为适配体链覆盖了MnCoCeO_x表面。当加入OTA时，适配体会因对OTA的更强亲和力而从MnCoCeO_x上分离，从而增强MnCoCeO_x的类氧化酶活性并产生更强的颜色信号。此外，智能手机的成像能力为低成本、现场和便携式检测提供了理想平台。然而，对基本图像捕捉和像素级分析的依赖进一步限制了准确量化的潜力[39]。为了解决这个问题，我们开发了一种便携式设备，该设备结合了激光耦合的硅二极管检测器和智能手机，用于测定液体样品的透射光强度。该设备包括一个650?nm的激光器和一个OPT-101硅二极管作为检测器，将光信号转换为电信号，然后通过模数转换器（ADC）将电压值转换为数字信号。通过监测3,3′,5,5′–四甲基联苯胺（TMB）–MnCoCeO_x反应系统中的OTA，评估了设备的性能，测试结果通过智能手机应用程序输出。测试结果表明，基于MnCoCeO_x的比色生物传感器具有极高的灵敏度，能够快速响应地原位检测食品样品中的霉菌毒素。

材料与设备

材料与设备的信息见补充材料。

类似花朵结构的MnCoCeO_x

MnCoCeO_x的合成方法参考了之前的报告，并进行了一些修改[40]。首先，在室温下不断搅拌下，将Co(NO₃)₂^{6H₂O（388?mg）、MnCl₂4H₂O（264?mg）、CeNO₃6H₂O（42?mg）、尿素（660?mg）和NH₄F（25?mg）加入30?mL甲醇中直至溶解。然后将反应混合物转移到100?mL聚四氟乙烯内衬的钢制高压釜中，在150?°C下加热8?小时。接下来，过滤掉沉淀物}

结构表征

MnCoO_x和MnCoCeO_x纳米花的形态和微观结构分别通过扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）进行了表征。如图1A所示，MnCoO_x显示出典型的绣球花状微观结构，放大视图（图1B）显示这些微球由相互连接的纳米片组成。掺铈后，观察到绣球花状球体还包含叶片结构（图1C和D）。

结论

总结来说，我们成功制备了一种便携式的、无标记的OTA比色适配体传感器，基于高效的三金属MnCoCeO_x，具有类氧化酶活性。Ce掺杂显著增加了MnCoO_x催化剂表面的氧空位数量和正电位。采用了一种简单且低成本的比色方法，利用MnCoCeO_x的性质和OTA–适配体的功能化，实现了高选择性和高灵敏度的检测

CRediT作者贡献声明

侯丹：撰写 – 审稿与编辑，实验研究。周慧欣：验证，实验研究。刘思琪：验证，实验研究。方欣瑜：验证。吴东平：软件，方法学。廖晓宁：撰写 – 审稿与编辑，监督，项目管理，概念构思。

资助

本工作得到了江西省自然科学基金（20232BAB205085）和国家自然科学基金（32060575, 32560608）的资助。

未引用参考文献

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利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。