《Micron》：Software for semi-automatic analysis of microscopic images of adhesion structures and protein colocalization in cells
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本研究开发了一个基于MATLAB的半自动脚本，用于高效检测和量化显微镜图像中的焦点粘附和纤维粘附结构，支持用户自定义参数和手动修正，同时提供双通道共定位分析和可视化结果，提升细胞粘附机制研究的效率与准确性。
乔安娜·哈尤杜克（Joanna Hajduk）|帕特里夏·特瓦达瓦（Patrycja Twardawa）|泽农·拉伊富尔（Zenon Rajfur）
雅盖隆大学精确与自然科学博士研究生院，波兰克拉科夫洛亚谢维茨瓦街11号（?ojasiewicza 11, 30-348 Cracow）
摘要
背景与目标
粘附结构（如焦点粘附和纤维粘附）是蛋白质复合物，它们通过整合素介导细胞与细胞外基质的结合。这些结构参与机械感应过程，将力从细胞微环境传递到细胞骨架。细胞与其环境之间的相互作用以及焦点粘附蛋白的作用是研究的重要领域。对显微图像中粘附结构进行准确、定量的分析对于深入理解这一课题至关重要。然而，细胞内这些结构的高度变异性和复杂性使得图像分析具有挑战性，无论是在主观性还是时间消耗方面。
方法
我们提出了一种新的半自动脚本，用于检测粘附结构并分析其参数，该脚本使用MATLAB 2021a开发，旨在解决细胞中焦点粘附和纤维粘附的精确图像分析问题。
结果
我们的脚本提供了一种比手动分析更高效、更少主观性的方法，同时仍允许用户控制分析过程。它可以在共聚焦图像中检测粘附结构，并测量形状、方向和在细胞内的空间分布等关键参数，此外还提供已识别粘附结构的可视化标记图。第二个附加组件能够计算同一细胞内代表不同染色细胞结构的两个共聚焦显微镜通道之间的相关系数，并生成可视化共定位图，从而进一步增强对细胞结构的分析。
引言
细胞感知并响应来自环境的各种机械信号的能力对于生理功能至关重要。这一过程称为机械转导，由基于整合素的粘附结构促进，这些结构将细胞与细胞外基质（ECM）蛋白连接起来。这些蛋白质复合物参与许多关键过程，包括细胞迁移、增殖和胚胎发生[1]、[2]、[3]。近年来，理解机械感应机制以及细胞对微环境机械特性的反应一直是广泛研究的重点。
根据分子组成、大小、在细胞内的位置和成熟阶段，可以区分三种类型的粘附结构（AS）。小的（<1微米）、在伪足边缘形成的早期粘附结构称为新生粘附。它们寿命短暂，大多数在1-2分钟内解体。有些可以进一步成熟为焦点粘附[4]、[5]、[6]。焦点粘附（FA）是更成熟的结构，与肌动蛋白应力纤维相连[3]、[7]。焦点粘附通常长1-5微米，宽1-2微米[8]。它们由多种蛋白质组成，如talin、paxillin、vinculin以及信号分子（如焦点粘附激酶FAK）。研究表明，焦点粘附中的蛋白质呈层状排列，跨膜整合素和肌动蛋白细胞骨架之间由约40纳米厚的多层粘附蛋白核心层分隔。FAK和paxillin位于更靠近整合素层的位置，而talin和vinculin则位于更中心的位置，talin以对角线方式排列，作为肌动蛋白纤维和整合素之间的直接连接[9]。焦点粘附可以进一步成熟为纤维粘附——与纤维连接蛋白纤维相关的延长结构，通常位于细胞内部靠近细胞核的区域[10]、[11]。
传统的粘附结构定量分析方法（如使用ImageJ等程序的手动分割[12]）存在若干缺点。这些方法耗时较长，因此不适用于分析包含大量焦点粘附的细胞数据集。这往往导致只分析选定的粘附结构，而这种选择可能具有主观性，并依赖于个人判断。另一方面，自动分析方法也存在挑战，因为粘附结构在大小和形状上具有多样性，而且显微镜图像的质量也各不相同。已经开发了几种软件工具用于至少部分自动化的焦点粘附分析。然而，许多这些工具存在局限性：有些不易在线获取，有些则针对特定的成像模式设计，或者使用和修改起来较为困难。为了分析显微图像中的粘附结构，已经开发了几种计算工具。Berginski及其同事开发了一个系统，用于分析活细胞的TIRF图像，特别适用于研究粘附结构的动态[13]、[14]。该系统通过Focal Adhesion Analysis Server（FAAS）这一免费在线工具提供。虽然该系统允许修改某些参数，但需要在服务器上进行在线处理，使得分析更加耗时，并限制了用户对分析过程的控制[13]。Würflinger等人提出了一种用于FA分割和焦点粘附时间延迟跟踪的算法[15]。然而，据我们所知，该软件并非开源。Buskermolen等人设计了一种自动化图像分析算法，用于分割肌动蛋白细胞骨架、细胞核和焦点粘附[16]。尽管该程序适用于细胞形态学分析，但其参数定制能力相对有限，可能限制了其在不同实验条件下的适应性。Hauke等人提出了一个基于Java的Focal Adhesion Filament Cross-correlation Kit（FAFCK），可以自动分割细胞中的焦点粘附和应力纤维，并允许对这些结构进行相关性分析[17]。该工具在参数调整方面具有灵活性，并支持时间延迟分析。
在生物样本中，共定位通常使用独立的图像分析工具进行评估。现有的工具包括基于像素强度的和基于对象的共定位方法，例如Fiji/ImageJ插件（如Coloc 2或EzColocalization [18]）以及基于Matlab的工具（如MatCol [19]）。值得注意的是，据我们所知，没有一种软件工具能够在单一工作流程中同时整合粘附结构分割和不同标记的通用共定位，而无需在独立的分割和共定位工具之间切换。
在本文中，我们提出了一种用于显微图像中粘附结构分析的半自动方法。我们的方法结合了自动过程的效率，如ROI选择、图像处理（对比度调整、去噪、背景减除、过滤）、分割、结构分类和标记以及属性量化。尽管如此，用户仍可以调整分割方法、过滤标准，并根据需要手动细化结构图，通过添加或移除对象和合并标签。自动功能的参数可以根据不同的成像条件和细胞或结构类型进行定制。此外，对于双染色图像，该脚本提供了高级功能，如计算两个选定通道之间的相关系数和生成共定位图，从而提供关于染色细胞结构之间空间关系的全面见解。
部分摘录
细胞模型
本研究中提出的粘附结构检测和共定位评估算法使用NIH/3T3细胞系（小鼠胚胎成纤维细胞，ATCC CRL-1658）进行了优化和测试。为了评估该脚本对不同细胞类型的适用性，该程序也在U2OS（骨肉瘤细胞系，ATCC HTB-96）上进行了测试（见补充图S1）。NIH/3T3细胞在添加了10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基（Biowest）中培养。
讨论
该脚本能够自动检测染色细胞的共聚焦显微镜图像中的粘附结构，并提供分析检测结构空间共定位的工具。有两个附加组件，每个都可以独立运行。在众多可能的方法中，我们提出的解决方案结合了数值数据和可视化图的生成，支持参数定制，并在适当配置后允许完全自动化操作
结论
所提出的脚本为共聚焦显微镜图像中粘附结构和染色蛋白的共定位分析提供了数值和可视化输出。它支持完全自动化的工作流程，同时在处理、分割和分类的关键阶段允许手动校正——例如结构编辑和参数调整。结果会自动导出为电子表格格式，以便进一步分析。
作为开源软件提供，该工具易于获取
CRediT作者贡献声明
泽农·拉伊富尔（Zenon Rajfur）：撰写——审阅与编辑，监督。帕特里夏·特瓦达瓦（Patrycja Twardawa）：撰写——原始草稿，软件开发，方法学设计，数据管理。乔安娜·哈尤杜克（Joanna Hajduk）：撰写——原始草稿，可视化处理，验证，实验设计。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
本研究由克拉科夫雅盖隆大学的“卓越计划——研究型大学”项目中的“研究支持模块”（RSM/89/HJ和RSM/94/LO）资助。
