多策略代谢工程方法用于提高重组大肠杆菌中3’-C-戊二烯基萘林吉宁的产量

《Molecular Catalysis》：Multi-strategy metabolic engineering approach to enhance 3′-C-prenylnaringenin production in recombinant Escherichia coli

多策略代谢工程优化重组大肠杆菌生产3'-C-普烯野基没食子酸，通过随机和饱和突变筛选获得高效突变体M3A3（L245H-V421P-K152R），其kcat/Km值提升6.08倍；优化mRNA二级结构及融合标签（GST），结合异戊烯醇利用途径（IUP）替代甲羟戊酸途径，并优化碳源（葡萄糖/麦芽糖），实现最大产量265.3 mg/L，较野生型提升23倍。

　　

Xin Yan|Wenli Xia|Linguo Zhao|Jianjun Pei

中国南京林业大学森林食品资源开发与利用国家重点实验室，南京 210037

摘要

本研究提出了一种多策略代谢工程方法，用于提高重组大肠杆菌（Escherichia coli）中3′-C-戊二烯基纳林根宁（3′-C-prenylnaringenin）的产量。我们针对Aspergillus fumigatiaffinis中的戊二烯基转移酶（AfPT）开发了一种系统优化策略，通过随机和饱和突变筛选出高活性突变体，随后通过组合突变构建了具有协同作用的多点突变体，最终获得了M3A3（L245H-V421P-K152R）突变体。M3A3的V_max值提高到51.84 nmol/min/mg，其k_{cat/Km值达到239.8 s?1 M?1，比野生型AfPT（33.88 s?1 M?1）提高了6.08倍。为了进一步提高3′-C-戊二烯基纳林根宁的产量，我们对AfPT的翻译起始区域的二级结构进行了合理优化，并筛选了合适的宿主菌株和融合标签以改善其表达。此外，研究发现异戊烯醇利用途径（IUP）在提供DMAPP方面优于甲瓦龙酸（MVA）途径，而葡萄糖和麦芽糖作为碳源显著增强了DMAPP的生成。在优化条件下，重组菌株BL21-M3A3-HS2-GST在5 mL TB-Glu培养基中的最大产量达到了265.3 mg/L，66小时生物转化过程中的摩尔转化率为85%，比野生型菌株提高了23倍。这种方法通过创新的多策略代谢工程克服了合成瓶颈，建立了高效的黄酮类化合物戊二烯基化微生物平台。}

引言

戊二烯基化是自然界中黄酮类化合物的重要结构修饰[1]，从高等植物中分离出了含有一个或多个戊二烯基团的戊二烯基化黄酮[2]。戊二烯基团通过增加脂溶性显著增强了黄酮的生物活性，从而促进了膜渗透性并增强了与目标蛋白的相互作用[[3], [4], [5]]。因此，戊二烯基化黄酮具有广泛的药理特性，包括抗菌、抗癌、抗氧化、抗病毒和抗炎作用[[6], [7], [8]]。例如，黄酮的8-戊二烯基化使其具有比纳林根宁更强的雌激素活性，有助于预防肌肉萎缩、潮热和骨质流失[7,9]。黄酮的6-戊二烯基化在乳腺癌细胞中表现出强烈的抗增殖效果，6-戊二烯基纳林根宁（6-PN）通过芳基烃受体（AhR）激动作用将雌激素代谢途径导向无毒的2-羟基化途径[10,11]。相比之下，3′-C-戊二烯基纳林根宁通过靶向线粒体功能破坏癌干细胞的能量代谢，同时抑制促肿瘤介质（如NO）并诱导ROS介导的细胞凋亡[12,13]。此外，3′-戊二烯基黄酮还表现出显著的酪氨酸酶抑制活性[14]，使其成为具有抗癌、抗炎和抗氧化特性的多靶点化合物。这些特性使其在制药、营养保健品和农业领域具有巨大潜力，但实际应用仍需克服生物利用度和可规模化生产方面的挑战。由于这些有前景的治疗特性，戊二烯基化黄酮作为潜在药物候选物受到了广泛关注。然而，传统的化学方法存在环境问题、不良副反应和低产率等缺点[15,16]。作为一种更可持续的替代方案，生物方法（如体内酶促戊二烯基化和体外生物转化）已成为生产这些有价值化合物的有效策略[[17], [18], [19]]。

戊二烯基转移酶（PTs）是一类催化将来自二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）的戊二烯基团添加到黄酮底物上的酶[20,21]。由于这些酶具有环保的催化特性，它们在可持续生产高价值戊二烯基化黄酮方面受到了广泛研究[22]。迄今为止，已成功克隆并功能表征了多种戊二烯基转移酶，包括膜结合的植物酶和可溶性的真菌变体[19,[23], [24], [25], [26]]。尽管已构建了一些重组菌株来生产戊二烯基化黄酮，但这些化合物（尤其是3′-C-戊二烯基黄酮）的高效生产仍然具有挑战性。因此，戊二烯基化黄酮的大规模工业应用和商业化目前仍不可行[3,19,27,28]。我们实验室之前的研究鉴定并功能表征了一种来自Aspergillus fumigatiaffinis的新戊二烯基转移酶（AfPT），其催化效率非常出色[29]。使用优化的体外酶系统，3 mM纳林根宁的催化产物为2.25 mM 3′-C-戊二烯基纳林根宁，质量浓度单位为742.5 mg/L[30]。然而，携带AfPT的重组菌株产生的3′-C-戊二烯基纳林根宁产量明显低于体外系统。

AfPT的催化效率、DMAPP的供应量以及酶的表达水平是影响重组菌株中戊二烯基化衍生物产量的关键因素。AfPT的最佳温度为50 °C。热稳定性测试表明，AfPT在50 °C下孵育4小时后仍保留了超过60%的活性[29]。然而，AfPT在30 °C下的催化效率远低于50 °C。由于重组菌株转化通常在30 °C左右进行，这种温度差异可能是导致产量低的关键因素。因此，通过蛋白质工程提高AfPT在30 °C下的催化效率是一种提高3′-C-戊二烯基纳林根宁产量的有前景策略。

为了提高微生物宿主体内DMAPP的可用性，采用了两种主要的代谢工程方法：(i) 通过过表达甲瓦龙酸（MVA）或甲基赤藓糖醇磷酸（MEP）途径基因来增强DMAPP的生物合成途径[31,32]；(ii) 引入异戊烯醇利用途径（IUP）[3,33,34]。尽管MVA和MEP途径存在反应步骤长和调控复杂等固有局限性，但通过途径优化，重组菌株仍能高效生产DMAPP[31,32]。IUP因其酶促步骤少和前体转化效率高而成为优化重组菌株中DMAPP池的突出研究目标[3,33,34]。

在大肠杆菌（Escherichia coli）中高效、可溶地表达高催化活性的异源酶基因对于提高目标产物的产量至关重要。最近，使用融合标签已成为提高酶稳定性、溶解性和表达水平的有效策略。已将多种标签（如麦芽糖结合蛋白（MBP）、N-利用物质蛋白A（NusA）、硫氧还蛋白A（TrxA）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）和改良的融合标签）与目标酶融合以增强其性能[35]。此外，mRNA翻译起始区域的二级结构是异源酶基因表达的关键因素，已通过筛选来调节异源酶基因的表达水平[[36], [37], [38]]。

在本研究中，我们采用了一种逐步的多维工程策略，通过分层修饰级联优化了AfPT。首先通过随机突变获得关键残基，然后通过饱和突变筛选出高活性突变体，最后通过组合突变构建了具有协同作用的多点突变体。同时，我们优化了mRNA的二级结构，筛选了增强溶解性的融合标签，改造了宿主菌株，并重构了代谢途径以实现3′-C-戊二烯基纳林根宁的高效生物合成。这种整合的“酶-宿主-过程”解决方案不仅实现了3′-C-戊二烯基纳林根宁的高产量，还为天然酶的工程化提供了一个通用范例，将促进天然药物的绿色合成发展。

部分内容摘录

质粒、菌株、培养基和化学品

本研究中使用的所有质粒和菌株列于表S1中。E.coli菌株DH5α和BL21（DE3）用于质粒扩增、重组酶生产和黄酮的体内转化。

使用含有适当抗生素的LB培养基和TB培养基来培养菌株。LB培养基含有10 g/L色氨酸、5 g/L酵母提取物和10 g/L NaCl。TB-Glu、TB-Gly、TB-Inu、TB-Dex、TB-MD、TB-Suc和TB-Mal培养基含有24 g/L酵母提取物、12 g/L色氨酸和12.54 g/L K₂HPO₄

AfPT的突变修饰

戊二烯基转移酶AfPT在优化的体外系统中表现出出色的催化效率，能够实现3′-C-戊二烯基纳林根宁的高产[29,30,43]。在我们之前的研究中，发现AfPT在30 °C（E. coli的标准培养温度）下的催化效率较低，这是全细胞生产的主要瓶颈。如表1所示，AfPT在30 °C下的催化效率（k_cat/K_m）仅为6.40 s?1M?1

结论

总之，本研究成功展示了一种多策略代谢工程方法，显著提高了重组E.coli中3′-C-戊二烯基纳林根宁的产量。通过对Aspergillus fumigatiaffinis戊二烯基转移酶（AfPT）进行系统优化，我们发现了具有协同作用的多点突变体，特别是M3A3（L245H-V421P-K152R）突变体，其k_cat/K_{m值提高了6.08倍}

资助

本工作得到了国家自然科学基金（21,978,135）的支持。

数据可用性

所有相关数据均包含在手稿中。

CRediT作者贡献声明

Xin Yan：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、软件、方法学、实验设计、数据分析、概念化。Wenli Xia：软件、方法学。Linguo Zhao：验证、监督、概念化。Jianjun Pei：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督、资金获取、概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。