破解硫驱动的自养反硝化过程中的药物抗性：一种基于多组学和人工智能的结构生物学综合方法

《Water Research》：Deciphering Pharmaceutical Resistance in Sulfur-driven Autotrophic Denitrification: An Integrated Multi-Omics Artificial Intelligence-Driven Structural Biology Approach

硫驱动自养反硝化系统（SdAD）在异丁苯丙酸（IBU）压力下的稳定性机制研究。通过210天连续流反应器实验结合多组学分析，发现SdAD系统通过微生物群落重组和代谢补偿实现功能稳定。结构生物学与人工智能技术揭示SQR酶中精氨酸残基为IBU关键结合位点，并验证硫氧化基因与精氨酸合成途径的协同调控。研究提出整合计算结构与多组学的系统生物学方法用于评估生物脱氮系统抗药性。

　　

Dong-Qi Huang | Sining Zhou | Yanyan Jia | Yujian Yan | Hui Lu

中山大学环境科学与工程学院，中国广州

摘要

硫驱动的自养反硝化（SdAD）是一种有前景的低碳氮去除技术；然而，其在药物压力下的稳定性和适应机制仍不甚明了。本研究使用布洛芬（IBU）作为代表性药物，来探究SdAD系统的响应。在210天的运行期间，该系统表现出卓越的功能稳健性，在从环境相关水平到高冲击负荷（100-2000 μg/L）的IBU浓度范围内，保持了高硫化物（97.46 ± 3.18%）和无机氮（99.17 ± 4.34%）去除效率。在宏观稳定性的基础上，群落水平分析显示，SdAD微生物组并未受到抑制，而是积极重组其组成和拓扑结构以适应选择压力。这种适应表现为微生物多样性的增强和应激诱导的网络模块化（特别是在100-500 μg/L时），以及硫氧化细菌与反硝化菌之间合作力的加强。为揭示这种韧性的具体分子驱动因素，我们将基于AlphaFold的结构建模与机器学习耦合的分子对接相结合。这使我们能够解析硫化物：醌氧化还原酶（SQR）的三维结构，并首次在药物压力下对SQR进行了结构-功能分析，发现精氨酸残基是IBU结合的关键相互作用热点。与这种结合机制一致，多组学数据进一步证实了涉及硫氧化基因协调调控和精氨酸生物合成途径转录上调的系统级调整。总体而言，这些发现揭示了SdAD群落如何通过涉及生态网络重组和代谢补偿的多层次策略来减轻药物毒性。

引言

目前，市政污水处理范式正在经历双重转变，即向可持续、低碳的氮去除方式转型，同时加剧了对持久性有机微污染物的斗争（Du et al., 2022; Kaetzl et al., 2025）。由于传统异养反硝化在碳源稀缺和运营成本方面的限制日益增加，硫驱动的自养反硝化（SdAD）已成为一种有前景的替代方案（Yuan et al., 2023）。通过利用还原型硫化合物（如元素硫、硫代硫酸盐）作为电子供体，SdAD提供了一种成本效益高的氮去除途径（Pokorna et al., 2015）。然而，SdAD的运行稳定性日益受到药物残留物普遍存在的威胁（Huang et al., 2023b）。

SdAD与药物之间的冲突可能根源于自养生物的特定代谢结构。与代谢多样的异养生物不同，SdAD依赖于由一组核心功能酶（尤其是硫化物：醌氧化还原酶（SQR））控制的高度专门化和刚性的电子传输链（Shao et al., 2010）。SQR是一种关键的膜相关黄素蛋白，催化生物硫化物（S^2-）氧化的第一步和限速步骤（Marcia et al., 2009）。通过将电子从S^2-转移到醌池中，SQR不仅防止了细胞内S^2-的毒性，还在环境条件波动的情况下维持了细胞内的氧化还原平衡和能量守恒（Jung et al., 2025）。因此，SQR是一个关键的代谢守门人；然而，这一关键作用也使整个系统变得脆弱（Nguyen et al., 2022）。药物可能作为特异性配体结合并抑制这些酶的氧化还原活性位点（Fan et al., 2023）。这表明，在污水处理厂观察到的性能下降不仅仅是由于一般的微生物毒性，而是由于对酶机制的精确分子级干扰。

尽管这些相互作用至关重要，但目前对其理解仍然相当肤浅。尽管有几项研究评估了药物对生物氮去除系统的影响，但大多数研究主要关注宏观反应器性能指标（如氮去除效率）或一般酶活性测定。虽然这些方法可以量化抑制的严重程度，但它们对药物与关键功能蛋白之间的分子级相互作用（特别是结构扰动和残基特异性结合机制）提供的见解有限（La Rosa et al., 2025）。具体来说，药物的确切结合位点和主要目标酶的身份尚未确定。这一知识空白主要是由于大多数功能性SdAD蛋白的晶体结构尚未解析。没有高分辨率的结构数据，传统的结构生物学技术无法应用于量化环境污染物与微生物酶之间的立体化学相互作用，从而在风险评估中造成了重大瓶颈（Fenner et al., 2021; Thompson et al., 2019）。

为了弥合宏观抑制与分子机制之间的差距，本研究结合了连续流实验、多组学分析、计算结构生物学和机器学习。选择布洛芬（IBU）作为代表性化合物，因为它是全球消费量最大的药物之一（约15,000吨/年），也是市政污水中普遍存在的污染物（Negarestani et al., 2023），以评估SdAD系统在药物压力下的功能稳定性。此外，SQR被选为SdAD蛋白质组的代表性酶；其在不同分类单元中的进化保守性和结构多样性使其成为构建整合分子特性、蛋白质结构和相互作用力的机器学习框架的理想模型（Berben et al., 2019）。首先通过长期反应器运行评估了系统响应，然后通过16S rRNA测序、宏基因组学和宏转录组学的交叉分析阐明了潜在的生物学机制。为了克服结构上的盲点，使用AlphaFold生成了SQR的高精度三维（3D）预测。随后，将多配体对接与机器学习模型相结合，系统地筛选相互作用模式、识别敏感的氨基酸残基并分析力场特征。这种综合策略不仅为药物-蛋白质扰动建立了预测框架，还为理解化学复杂环境中生物污水处理系统的韧性提供了通用范式。

连续流反应器操作和化学分析

本研究构建并操作了一个工作体积为2.0 L的实验室规模上流式厌氧污泥覆盖反应器。反应器接种了从市政污水处理厂获取的厌氧种子污泥。在开始主要实验之前，该污泥经历了为期约30天的针对性驯化阶段，以富集功能性的硫自养反硝化群落。反应器温度保持在25 ± 1°C。

SdAD系统对IBU压力的韧性

在硫代谢方面，中间物种（SO₃^2-和SO₄^2-）的动态表现出明显的趋势，即最初下降后部分恢复（图1a）。具体来说，在第2-3阶段（100和500 μg/L IBU）时，出水中SO₄^2-浓度下降，但在第4-5阶段（1000和2000 μg/L IBU）时又回升。这种暂时的下降可能是由于IBU最初抑制了关键的硫氧化酶并破坏了电子转移。

结论

本研究表明，SdAD系统在从环境相关水平到高冲击负荷的IBU压力下表现出卓越的韧性和功能稳定性。这种稳定性得益于微生物组成和相互作用网络的协调调整，使群落能够主动适应压力并避免均匀的功能抑制。具体来说，出现了“应激诱导的凝聚力”，其特征是群落的增强

CRediT作者贡献声明

Dong-Qi Huang：撰写 - 原稿撰写、可视化、软件开发、实验研究、正式分析、模型构建。Sining Zhou：撰写 - 审稿与编辑、概念构思。Yanyan Jia：撰写 - 审稿与编辑。Yujian Yan：方法学研究、实验研究。Hui Lu：撰写 - 审稿与编辑、监督、资金获取、概念构思。

数据可用性

所有数据均可在正文或补充信息中找到。

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利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国自然科学基金（编号52131001）和中国国家重点研发计划（编号2024YFE0201400）的支持。