《Cancers》：Blu-Ray-Based Quantification of CD98+ Extracellular Vesicles for Early Detection of Hepatocellular Carcinoma
Su-Liang Chen,
Yong Seng Low,
Bo-Ru Huang,
Che-Hao Lu,
Wei-Chun Lan,
Ren-Huang Wu,
Hsing-Ying Lin,
Andrew Yueh and
En-Chi Hsu
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本研究针对当前肝细胞癌（HCC）早期诊断工具，如超声检查和甲胎蛋白（AFP），在非病毒性HCC中敏感性不足的临床挑战。研究人员聚焦于肝癌细胞释放的表面富含跨膜癌蛋白CD98的胞外囊泡（EVs），利用自主研发的高亲和力抗CD98单克隆抗体和蓝光ExoCounter检测平台，在早期（I/II期）非病毒性HCC患者血浆中实现了对CD98+EVs的精准定量。结果表明，CD98+EV水平在患者中显著升高，能有效区分早期HCC与健康人群，尤其对于≤3厘米的小肿瘤，其诊断敏感性（59%）显著优于传统AFP（33%）。该研究为早期非病毒性肝细胞癌提供了一种极具前景的新型无创液体活检生物标志物。
肝癌是全球第六大常见癌症和第三大癌症相关死亡原因，其中肝细胞癌约占全部病例的85%。尽管针对病毒性肝炎的筛查和疫苗接种计划有效降低了病毒相关肝癌的发病率，但由非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）等代谢综合征引起的肝癌却在不断攀升。这类肝癌往往发现较晚，预后更差。目前，临床常规筛查依赖于腹部超声和血清甲胎蛋白（Alpha-fetoprotein, AFP）检测，但两者都有明显局限性。超声对小于2厘米的肿瘤敏感性较低，尤其在有肝纤维化或脂肪变性的肝脏中，图像判读更加困难。而AFP作为一项血液指标，不仅敏感性不足，对早期小肿瘤的检出率更低，还缺乏特异性，在慢性肝病、妊娠等情况下也会升高。因此，寻找一种高灵敏度、高特异性且适用于早期非病毒性肝癌的血液生物标志物，成为临床亟待解决的迫切需求。
近年来，胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）作为一种液体活检（Liquid Biopsy）工具受到广泛关注。这些由细胞释放的纳米级囊泡，携带着来源细胞的蛋白质、核酸等“分子名片”，在血液中稳定存在，被认为是理想的疾病诊断标志物载体。在这项发表于《Cancers》的研究中，科学家们将目光投向了CD98（又称SLC3A2），一种在包括肝癌在内的多种癌症中高表达的跨膜糖蛋白。他们假设，肝癌细胞释放的胞外囊泡表面会富集CD98，从而使其成为一种癌症特异性的循环生物标志物。
为了验证这一想法，研究团队开展了一系列探索。他们首先通过分析公共数据库和临床样本，确认CD98在肝癌组织中普遍高表达，且与肿瘤分期、大小、病因等临床因素无关，提示其作为早期诊断标志物的潜力。接着，他们成功从肝癌细胞培养上清和患者血浆中分离出表面带有CD98的胞外囊泡，并利用自主研发的高亲和力抗CD98单克隆抗体（NHRI#20D5），结合一种名为ExoCounter的蓝光（Blu-ray）高灵敏度检测平台，建立了一套定量检测血浆中CD98+EVs的方法。最后，他们在136名早期（I/II期）非病毒性肝癌患者和50名健康对照的血浆样本中进行了验证。
研究采用的关键技术方法包括： 通过分析GTEx、TCGA、CLCA等公共数据库和商业组织芯片，评估CD98在肝癌中的表达谱；从肝癌细胞系和患者血浆中分离胞外囊泡，使用蛋白质免疫印迹、透射电镜、纳米颗粒跟踪分析等技术进行鉴定和表征；利用流式细胞术和自主研发的单克隆抗体，筛选并验证靶向CD98的高亲和力抗体；核心检测技术是基于蓝光光盘的ExoCounter平台，用于对血浆样本中的CD98+EVs进行精确定量；运用单囊泡荧光成像和受激发射损耗显微镜等超分辨成像技术，在单颗粒水平验证CD98在EVs上的定位与表达。
3.1. CD98在肝癌各期均高表达
研究人员首先在转录组层面证实，CD98的mRNA在肝癌组织中显著高于正常肝组织，且其高表达状态贯穿巴塞罗那临床肝癌（Barcelona Clinic Liver Cancer, BCLC）分期的所有阶段（0期至C期），但与患者总生存期和肿瘤大小无显著相关性。免疫组化分析进一步在蛋白水平验证了这一结果，显示从早期（I期）到晚期的肝癌组织均呈现强烈的CD98膜染色，而正常肝组织仅呈弱表达或不表达。重要的是，CD98的表达水平不受肝硬化、病毒感染、饮酒、吸烟等已知肝癌风险因素的影响，表明其作为生物标志物具有广泛的适用性。相比之下，当前常用的血液标志物AFP和PIVKA-II对早期肝癌的诊断敏感性均不理想。
3.2. CD98存在于肝癌细胞分泌及患者血浆的胞外囊泡中
研究证实，CD98是胞外囊泡表面的一种丰富蛋白。他们在三种肝癌细胞系（HepG2, Hep3B, PLC5）分泌的EVs中均检测到了CD98蛋白，并通过蛋白质免疫印迹验证了EVs的标志物（如CD63, CD9）。更重要的是，在早期非病毒性肝癌患者的血浆EVs中也成功检测到CD98。透射电镜图像显示，纯化后的血浆EVs具有典型的囊泡形态。通过对比三种不同的抗CD98抗体，研究团队确认其自主研发的单克隆抗体NHRI#20D5在流式细胞术和ExoCounter检测中均表现出最高的结合亲和力和特异性。
3.3. 单囊泡分辨率下的CD98+胞外囊泡可视化
利用多重荧光标记和单囊泡成像技术，研究人员直观地观察到CD98与经典的EVs标志物CD63、CD9在肝癌细胞来源的单个EVs上存在共定位。图像分析量化显示，约有33.0%的EVs为CD98阳性，其中大部分与CD63或CD9共表达，但也存在仅表达CD63或CD9而不表达CD98的EVs亚群。这证实了CD98+EVs代表了一类独特的经典EVs亚群。
3.4. CD98+EVs在早期肝癌患者血浆中水平升高
研究的核心发现来自于对临床血浆样本的ExoCounter检测。结果显示，早期非病毒性肝癌患者血浆中的CD98+EVs绝对计数显著高于健康对照。为了消除个体间总EVs数量的差异，研究人员计算了“CD98+EV指数”（CD98+EV计数归一化至总EV浓度），该指数进一步增强了区分能力。受试者工作特征曲线分析表明，CD98+EV指数在区分早期肝癌与健康人时，曲线下面积达到0.743，诊断敏感性和特异性分别为64%和86%。尤为突出的是，对于肿瘤大小≤3厘米的早期小肝癌，CD98+EV指数的诊断敏感性仍保持在59%，显著优于AFP在20 ng/mL和200 ng/mL截断值下的敏感性（分别为33%和8%）。该指数与患者的吸烟、饮酒、肝硬化、年龄、性别、AFP水平、肿瘤分期和大小等临床变量均无显著相关性，再次印证了其作为独立诊断标志物的潜力。
研究结论与讨论部分强调， 本研究首次将循环CD98+EVs定量为一种新型的肝癌血液生物标志物，并利用高灵敏度的ExoCounter平台实现了检测。CD98在肝癌早期即稳定高表达，且与病因无关，这为其成为理想的早期诊断靶点奠定了基础。所建立的CD98+EV指数在检测早期、特别是小体积的非病毒性肝癌方面，表现出优于传统AFP的敏感度，为解决当前临床早期诊断的瓶颈问题提供了新思路。ExoCounter平台结合特异性单克隆抗体的策略，为未来无创、精准的液体活检应用展示了可行路径。当然，该研究也存在一定局限性，例如尚未评估CD98+EVs在其他高表达CD98的癌症（如肺癌、结肠癌）中是否也会升高，其诊断特异性有待在更广泛的癌种中验证。此外，CD98+EVs是否通过传递致癌信号参与肝癌进展，也是未来值得探索的功能性问题。研究人员展望，未来可将CD98+EV指数与AFP、PIVKA-II等现有标志物结合，构建多模态诊断模型，有望进一步提升对早期肝癌的检出能力。总之，这项研究突出了CD98+EVs作为早期肝细胞癌，尤其是非病毒性肝癌，新型无创诊断生物标志物的巨大潜力，为改善这一日益严峻的公共健康问题的临床管理带来了希望。
