综述：长链非编码RNA来源的肽作为肿瘤新抗原的新来源：将免疫肽组学扩展至经典编码区之外

《Biology》：Long Non-Coding RNA–Derived Peptides as a Novel Source of Tumor Neoantigens: Expanding the Immunopeptidome Beyond Canonical Coding Regions Ismael López-Calvo, Inés Bao-Camacho, Samuel Martín-Revuelta, Cora Rey-Souto, Anahir Franco-Gacio, José Manuel Pérez-Martínez, Iván Sandino-Somoza, álvaro Mourenza, Esther Rodríguez-Belmonte and ángel Vizoso-Vázquez + 3 authors

本文系统评述了长链非编码RNA来源的肽（lncPEPs）作为一类新型肿瘤新抗原的研究进展。综述聚焦于低突变负荷肿瘤免疫治疗的瓶颈，阐述了lncPEPs从非经典翻译机制（如smORFs、非AUG起始、IRES等）的生物发生，到经MHC-I分子加工呈递并激活CD8+T细胞的完整免疫识别通路。文章详细介绍了结合翻译组学、免疫肽组学和生物信息学（如NetMHCpan、DeepHLApan）的多组学鉴定策略，以及在3D肿瘤模型（如类器官）中验证其免疫原性的功能实验方法。最后，以卵巢癌为例，探讨了lncPEPs在拓宽可靶向抗原库、开发个体化疫苗和基于T细胞的免疫疗法（如TCR-T）中的转化前景。

　　

引言：超越经典编码区的免疫肽组

传统的癌症免疫疗法，如针对CTLA-4和PD-1的免疫检查点阻断，在临床应用中已展现出显著疗效，但其在低突变负荷肿瘤（如卵巢癌、胰腺癌和胶质母细胞瘤）中的效果仍然有限。这些肿瘤的“冷”肿瘤微环境（TME）和经典突变来源新抗原的匮乏，构成了当前免疫治疗的主要瓶颈。近年来的突破性发现揭示，肿瘤的免疫肽组——即细胞表面由主要组织相容性复合体（MHC，在人类中为HLA）分子呈递的全部肽段库——远不止来源于经典的蛋白质编码区。通过非经典翻译机制，大量来自非编码转录本的肽段被纳入其中，极大地扩展了潜在的抗原来源。其中，长链非编码RNA（lncRNAs）——曾被普遍认为不编码蛋白质的调控性RNA——因其内部存在可翻译的小开放阅读框（smORFs），而成为一类令人意外的、具有免疫原性的肽段（lncPEPs）来源。

肿瘤新抗原：从编码突变到非编码宝藏

传统上，肿瘤新抗原被定义为由肿瘤细胞蛋白质编码基因的体细胞突变产生的肽段。然而，蛋白质组学和免疫肽组学的进展极大地拓宽了这一概念。新抗原不仅来源于移码突变产生的新开放阅读框肽（NOPs）、异常剪接事件（新连接点）以及非AUG起始翻译，更有一部分来源于包括lncRNAs在内的非编码转录本。有研究表明，在鼠源细胞系和白血病患者样本中鉴定的肿瘤特异性抗原（TSAs）中，高达90%来源于非编码区域。lncRNAs由于具有高度的组织和环境表达特异性，其衍生的肽段相比基于突变的新抗原，可能具有更高的肿瘤选择性和在患者亚群中复现的潜力，为低突变负荷肿瘤提供了宝贵的、可共享的新抗原来源。

lncRNAs：从“暗物质”到“肽工厂”

lncRNAs是长度超过200个核苷酸的非编码RNA。尽管它们缺乏长开放阅读框，但许多lncRNAs含有可翻译的smORFs，能够编码少于100-150个氨基酸的短肽或微肽。这些lncPEPs的生物发生涉及多种非经典机制，包括使用近同义起始密码子（如CUG、GUG）、依赖内部核糖体进入位点（IRES）的帽非依赖性翻译，以及受到RNA修饰（如m⁶A）的调控。这些翻译产物随后进入细胞内蛋白降解途径，为抗原呈递提供了原料。

抗原加工与呈递：从胞内肽到免疫信号

lncPEPs要成为具有免疫原性的新抗原，关键在于被免疫系统识别。这一过程主要依赖于MHC-I类分子途径。胞浆内的lncPEPs首先被蛋白酶体或免疫蛋白酶体降解为短肽片段。随后，这些肽段通过抗原加工相关转运蛋白（TAP）被运送到内质网（ER）中，在那里被ER氨基肽酶（ERAP）进一步修剪，并在由TAP、钙联接蛋白、钙网蛋白等组成的“肽段装载复合物”协助下，装载到新合成的MHC-I重链和β₂微球蛋白异二聚体上。稳定的肽段-MHC-I复合物随后经由高尔基体转运至细胞表面。当细胞毒性CD8⁺T细胞表面的T细胞受体（TCR）识别出这一“非我”复合物时，T细胞便被激活、增殖并分化为效应细胞，对呈递该抗原的肿瘤细胞发起攻击。

发现lncPEP新抗原的多组学武器库

鉴定lncPEP来源的新抗原（neoAgs-lncRNA）是一个系统工程，需要多组学技术的整合。首先，通过翻译组学技术（如核糖体图谱测序Ribo-seq）鉴定lncRNAs中实际被翻译的smORFs。同时，利用转录组测序（RNA-seq）获取lncRNA的表达谱。这些信息被用于构建包含非经典开放阅读框的定制化蛋白质数据库。接着，运用免疫肽组学技术：通过免疫沉淀富集肿瘤细胞表面的MHC-I-肽段复合物，然后进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，将获得的质谱图与定制数据库进行比对，从而直接鉴定出被天然呈递的lncPEPs。最后，借助生物信息学工具（如NetMHCpan、NetMHCstabpan、DeepHLApan）预测这些肽段与患者特定HLA等位基因的结合亲和力与复合物稳定性，以初步筛选出高潜力的候选新抗原。

从预测到验证：评估免疫原性的金标准

计算预测和质谱鉴定是发现的第一步，但必须通过功能实验验证其真正的免疫原性。常用的方法包括：使用酶联免疫斑点技术（ELISpot）检测肽段刺激后T细胞分泌干扰素-γ（IFN-γ）的能力；利用pHLA多聚体（如四聚体）通过流式细胞术直接检测和分选抗原特异性的CD8⁺T细胞；在共培养实验中评估T细胞对呈递特定lncPEPs的肿瘤细胞的杀伤能力。此外，表面等离子共振（SPR）或生物层干涉技术（BLI）可用于精确测量TCR与pHLA复合物之间的结合亲和力与动力学参数。这些实验共同证实候选肽段能否在生理条件下引发特异且有效的T细胞免疫应答。

临床转化的桥梁：先进的临床前模型

传统的二维（2D）细胞培养难以模拟复杂的肿瘤微环境。为了更真实地评估靶向lncPEPs的免疫疗法效果，三维（3D）肿瘤模型（如肿瘤球体、类器官）与免疫细胞（如T细胞）的共培养系统成为关键工具。这些模型能更好地再现肿瘤的异质性、细胞外基质相互作用以及缺氧等生理条件。在3D模型中，可以直观地评估工程化T细胞（如表达特异性TCR的TCR-T细胞）对肿瘤的浸润能力和杀伤效果，为个体化T细胞疗法的开发提供可靠的临床前数据。

挑战与展望：通向精准免疫治疗之路

尽管前景广阔，但lncPEPs的临床转化仍面临诸多挑战。技术层面，其低丰度、非经典起源给质谱鉴定和生物信息学分析带来困难，数据库注释不全也增加了假阳性风险。生物学层面，需要确认lncPEPs在正常组织中的表达情况，以评估治疗可能带来的脱靶毒性。临床层面，肿瘤的高度异质性可能导致抗原丢失，而免疫抑制性微环境可能削弱T细胞反应。此外，个体化新抗原疫苗或TCR-T疗法从鉴定、验证到生产的流程复杂、成本高昂，需要建立标准化流程。

然而，lncPEPs为克服低突变负荷肿瘤的免疫治疗困境提供了充满希望的新路径。随着单细胞测序、空间转录组、CRISPR筛选等新技术的融合应用，我们将能更精准地描绘肿瘤免疫肽组图谱，识别出最具治疗潜力的共享型或私有型lncPEP新抗原。未来，将lncPEPs与免疫检查点抑制剂、癌症疫苗或其他疗法联用，有望将更多的“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤，最终为更广泛的患者群体提供高效、精准的免疫治疗方案。