《Biology》：Multiepitope-Based Peptide Vaccine Against A35R Glycoprotein and E8L Membrane Protein of Monkeypox Virus Using an Immunoinformatics Approach
Laaiba Attique,
Syed Babar Jamal,
Tayyaba Gulistan,
Adnan Haider,
Deeba Amraiz,
Sumra Wajid Abbasi,
Sajjad Ahmad and
Mohammad Abdullah Aljasir
编辑推荐：
为应对猴痘病毒（MPXV）在全球快速传播的公共卫生挑战，研究人员利用免疫信息学反向疫苗学策略，设计了一种靶向病毒关键表面蛋白A35R和E8L的多表位疫苗。该疫苗由筛选出的B细胞和T细胞表位构建而成，计算分析显示其具有高抗原性、结构稳定性、广泛的HLA人群覆盖率，并能有效激活体液与细胞免疫应答，为后续实验验证提供了一种有前景的候选方案。
在全球公共卫生领域，一种曾主要流行于非洲部分地区的病毒——猴痘病毒（Monkeypox Virus, MPXV），自2022年起引发了跨越多国、波及六大洲104个国家的疫情，敲响了新的警钟。这种病毒与天花病毒同属正痘病毒属，临床症状相似，可导致发热、淋巴结肿大及特征性皮疹。尽管已有针对天花的疫苗（如ACAM2000）被用于应对猴痘，但其存在心肌炎等副作用风险，且保护效果并非百分之百。面对病毒的快速传播和现有疫苗的局限性，开发更安全、更高效的新型疫苗迫在眉睫。这正是《Biology》期刊上发表的这项研究——“Multiepitope-Based Peptide Vaccine Against A35R Glycoprotein and E8L Membrane Protein of Monkeypox Virus Using an Immunoinformatics Approach”所要解决的核心问题。研究人员没有走进传统的实验室，而是首先坐进了“数字实验室”，利用前沿的计算生物学方法，试图从头设计一款针对猴痘病毒的“蓝图”疫苗。
为了达成这一目标，研究团队主要运用了免疫信息学（Immunoinformatics）与反向疫苗学（Reverse Vaccinology）的核心技术流程。他们首先从数据库中获取了猴痘病毒两个关键表面蛋白——A35R糖蛋白和E8L膜蛋白的序列。随后，通过一系列生物信息学工具和服务器，系统地进行了目标蛋白的抗原性、过敏原性及与人类蛋白质同源性分析；预测并筛选了能引发B细胞免疫（体液免疫）和T细胞免疫（细胞免疫）的潜在表位（Epitope）；利用分子对接模拟了疫苗候选物与人体天然免疫受体TLR-4的结合；并通过分子动力学模拟评估了其复合物的结构稳定性。最后，还进行了人群覆盖分析以评估其理论上的普适性，以及免疫模拟来预测其激发免疫应答的潜力。
研究结果
3.1. 候选免疫靶标的抗原性与过敏原性测定
通过Vaxijen 2.0服务器评估，A35R和E8L蛋白的抗原性评分分别为0.5和0.5316，且均被预测为非过敏原，符合疫苗靶点要求。
3.2. 与宿主蛋白同源性的确定
通过BLASTp比对人类蛋白质组，确认这两个病毒蛋白与人类蛋白质无显著同源性，避免了潜在的自体免疫风险，适合用于人用疫苗开发。
3.3. 候选靶标蛋白的理化性质与结构分析
使用ExPASy ProtParam等工具分析了靶标蛋白的理化参数。预测显示A35R含有6个二硫键，而E8L由于半胱氨酸少于两个，无法形成二硫键。利用trRosetta预测的三级结构模型显示高置信度，为后续表位筛选提供了结构基础。
3.4. B细胞和T细胞表位的预测与分析
从A35R蛋白中鉴定出5个B细胞表位，从E8L蛋白中鉴定出8个B细胞表位，并评估了其抗原性与非过敏原性。同时，预测了MHC I类和MHC II类T细胞表位。经过严格筛选（抗原性>0.4、非过敏、无毒、水溶性好），最终从A35R中获得了7个MHC I和5个MHC II表位，从E8L中获得了5个MHC I和7个MHC II表位，用于疫苗构建。
3.5. 人群覆盖率
将筛选出的表位及其对应的HLA（人类白细胞抗原）等位基因提交至IEDB人群覆盖率分析工具。计算显示，该疫苗设计对MHC I类等位基因的全球人口覆盖率为83.57%，对MHC II类的覆盖率为88.8%。对西非和中非这两个猴痘流行区的覆盖率分别达到89.6%和87.3%，表明其具有广泛的潜在适用性。
3.6. 多表位疫苗的构建与组装
将筛选出的B细胞、MHC I和MHC II表位，通过特定的连接肽（EAAAK、AAY、GPGPG、KK）连接起来，并在N端添加了来自50S核糖体的L7/L12蛋白作为佐剂以增强免疫原性，在C端添加了6xHis标签。最终构建出一个包含多表位的疫苗序列。
3.7. 溶解度与理化性质分析
疫苗构建体的抗原性评分为0.5614，被预测为非过敏原且无毒。理化性质分析显示其稳定性指数为36.43，表明结构稳定，并具有良好的水溶性。
3.8. 二级与三级结构的外推与验证
疫苗构建体含有591个氨基酸。二级结构预测显示其由α螺旋、延伸链和无规卷曲组成。通过Swiss-Model预测三级结构，并利用GalaxyRefine进行优化。优化后的模型（模型2）具有较低的RMSD（0.360）和较高的质量评分。通过PROCHECK生成的拉氏图显示95.7%的残基位于最允许区，ProSA-web评估的Z得分为-4.1，均表明模型质量高、结构稳定。
3.9. 二硫键工程
为了增加疫苗结构的稳定性，使用Disulfide by Design工具预测了10对可突变为半胱氨酸以形成二硫键的残基对，为后续的蛋白质工程改造提供了方向。
3.10. 疫苗表达分析
将疫苗的氨基酸序列反向转录为核苷酸序列，并使用Jcat服务器进行密码子优化，使其更适于在大肠杆菌等宿主中表达。优化后的密码子适应指数（CAI）为0.9560，GC含量为68.3023。随后，将优化后的基因序列通过in silico（计算机模拟）克隆方式插入pET-28a(+)表达载体，模拟了其在原核系统中的表达潜力。
3.11. 蛋白质-蛋白质对接分析
将疫苗构建体与天然免疫关键受体TLR-4进行分子对接。使用ClusPro 2.0对接后，选取了结合能最低（-695.6 kcal/mol）且相互作用伙伴最多（53个）的模型。分析表明，疫苗主要与TLR-4受体的B链和D链发生相互作用，形成了稳定的复合物，这从理论上支持了疫苗能够有效被免疫系统识别并启动免疫应答。
3.12. 分子动力学模拟
对疫苗-TLR-4复合物进行了100纳秒的分子动力学模拟。虽然整体均方根偏差（RMSD）值较高（平均13.59 ?），这主要归因于多表位构建体中存在的柔性环区，但系统的回转半径（Rg）和残基涨落（RMSF）在模拟过程中保持相对稳定，表明复合物的整体结构紧凑性和结合界面在动力学上是稳定的，验证了对接结果的可靠性。
3.13. 自由能估算
利用MM-PBSA（分子力学泊松-玻尔兹曼表面积）方法计算了复合物的结合自由能。结果显示，疫苗与TLR-4的结合在热力学上是有利的，净结合自由能（GB和PB）分别为-82.7535 kcal/mol和-25.6967 kcal/mol，其中范德华相互作用和静电相互作用是主要驱动力，进一步从能量角度证实了二者结合的稳定性。
3.14. 免疫模拟
使用C-ImmSim服务器进行免疫模拟。结果显示，接种该疫苗候选物后，模拟体内出现了强烈的免疫应答：IgM和IgG抗体滴度在接种后第5天开始上升，第15天达到峰值；同时，B细胞、辅助性T细胞（Th）、细胞毒性T细胞（Tc）以及Th1、Th2、Th17等亚群的数量显著增加，细胞因子水平也随之升高。这预测了该疫苗能够有效激发强大的体液免疫和细胞免疫应答。
研究结论与意义
本研究成功设计了一种针对猴痘病毒A35R糖蛋白和E8L膜蛋白的多表位in silico疫苗。该疫苗基于精心筛选的、具有高免疫原性、抗原性、非过敏性、无毒且与人类非同源的线性表位构建而成，显示出激发强大体液和细胞免疫应答的潜力。通过全面的计算分析，包括蛋白结构预测与验证、分子对接、分子动力学模拟、结合自由能计算、人群覆盖率分析和免疫模拟，研究人员从多个维度证实了该疫苗构建体的稳定性、与免疫受体的有效结合能力以及在理论上的广泛保护潜力。
这项研究的核心意义在于，它提供了一种针对猴痘病毒的新型疫苗设计策略和具体的候选方案。与以往多数针对单一病毒蛋白的研究相比，本设计同时靶向两个对病毒至关重要的表面蛋白，有望提供更广泛的免疫覆盖。更重要的是，它展示了免疫信息学和反向疫苗学在应对新发突发传染病时的强大能力，能够大幅缩短疫苗发现的早期阶段，为后续的体外实验、动物模型验证乃至临床试验提供了明确的方向和坚实的基础。当然，作者也明确指出，计算预测有其局限性，必须通过实际的生物学实验来最终验证该疫苗的安全性、免疫原性和保护效力。尽管如此，这项研究无疑是迈向开发更安全、高效猴痘疫苗的充满希望的第一步。
