用于检测感染水稻的Magnaporthe oryzae的统一引物检测（UPED）系统：从传统PCR到基于CRISPR Cas12a的检测系统的比较研究

《Analytica Chimica Acta》：Unified Primer Enabled Detection (UPED) system for Magnaporthe oryzae infecting rice: A comparative study from conventional PCR to CRISPR Cas12a based detection systems

本研究首次统一比较了六种分子检测方法（PCR、qPCR、LAMP、RPA及CRISPR-Cas12a联用），以多拷贝Pot2转座子为靶标，发现CRISPR-Cas12a结合LAMP或RPA的方法灵敏度最高（1拷贝/反应），且特异性强，适用于田间快速检测，为稻瘟病防控提供新策略。

　　

R. Karan | M.K. Prasannakumar | Harvinder Kour Khera | J. Harish | Swathi S. Patil | Pramesh Devanna | C. Manjunatha | Rakesh Kumar Mishra

印度卡纳塔克邦班加罗尔GKVK大学植物病理学系PathoGenomics实验室，邮编560065

摘要

背景

稻瘟病由Magnaporthe oryzae引起，是危害水稻最严重的真菌病原体之一。早期、快速且准确的检测对于有效控制疾病和防止疫情爆发至关重要。传统的和等温分子检测方法在灵敏度和实际应用方面存在很大差异，这使得难以确定哪种方法具有可靠的检测效果。本研究旨在使用相同的引物集，对六种分子检测技术进行首次统一、并列的比较，以确定最敏感、最特异且适合田间应用的M. oryzae检测方法。

结果

本研究评估了六种诊断方法，包括PCR、qPCR、LAMP、RPA以及结合LAMP或RPA的CRISPR-Cas12a技术，这些方法都针对M. oryzae中的多拷贝Pot2转座子。通过10倍基因组DNA稀释（10⁹至10^?1拷贝/反应）进行的灵敏度测试显示，LAMP-CRISPR和RPA-CRISPR的灵敏度最高，能够检测到低至1拷贝/反应的病原体。LAMP和qPCR的灵敏度分别为10²和10³拷贝/反应，而RPA和PCR的灵敏度则分别限制在10⁵和10⁶拷贝/反应。所有方法均表现出高特异性，且未与10种非目标水稻真菌病原体发生交叉反应。在17个有症状的样本上进行田间验证后，确认基于CRISPR的方法优于传统方法，能够检测出其他平台遗漏的阳性样本。这是首次在同一引物集下对多种M. oryzae检测方法进行系统比较的研究。

意义

我们的研究结果表明，基于CRISPR-Cas12a的平台结合等温扩增技术具有高灵敏度和特异性。基于CRISPR的检测方法适用于田间M. oryzae的检测。使用统一的引物集使得各方法之间的直接比较成为可能。这些结果凸显了基于CRISPR的诊断技术在早期病原体检测方面的潜力，有助于快速采取干预措施并改善稻瘟病的管理。

引言

稻瘟病是由真菌病原体Magnaporthe oryzae（同义词Pyricularia oryzae）引起的，这种破坏性病害会严重影响全球水稻产量，在有利条件下可导致30-50%的产量损失，从而威胁全球粮食安全[1]。稻瘟病的主要症状包括叶瘟、颈瘟、节瘟和谷粒变色。M. oryzae还会感染小麦、大麦、手指小米、珍珠小米、狐尾小米等其他小米品种[2,3]。关于M. oryzae的一个主要问题是其种子传播特性：受感染的种子是病原体的主要传播源，促进了病原体在远距离的传播，并在新区域引发疾病爆发[4,5]。此外，M. oryzae会产生空气传播的孢子，在温暖潮湿的条件下能快速扩散。从受感染的种子和组织中早期准确检测出M. oryzae对于有效控制和预防疫情至关重要[6,7]。 在分子检测技术出现之前，M. oryzae的检测依赖于视觉症状、显微镜检查和培养，这些方法耗时且需要专业人员操作[8]。这些局限性促使人们广泛采用分子诊断方法，因为它们具有更高的灵敏度、特异性和速度[9]。多年来，已经开发出多种分子诊断技术来检测M. oryzae>，从传统的PCR到先进的基于CRISPR的技术[6]。PCR和qPCR因其灵敏度和特异性而被广泛使用，但这些方法需要复杂的仪器（如热循环仪），限制了其在田间的应用[10]。等温扩增技术（如重组酶聚合酶扩增RPA和环介导的等温扩增LAMP）作为一种有前景的替代方案出现，它们在设备要求较低的情况下能够实现快速高效的病原体检测[11]。LAMP在30-60分钟内可大量扩增DNA，并能提供比色或荧光读数[12]；而RPA在较低的反应温度（37-42°C）下通常能在20分钟内得出结果[13]。这些特性使得等温扩增技术成为田间诊断中PCR的理想替代方案[13]。 近年来，基于CRISPR的检测系统由于其极高的特异性和快速的检测能力而彻底改变了分子诊断领域。特别是CRISPR-Cas12a系统，通过利用其切割活性在识别目标DNA序列时产生荧光或侧向流动信号，成功应用于病原体检测[14]。与传统PCR甚至等温扩增方法不同，基于CRISPR-Cas12a的检测方法通过结合核酸扩增和CRISPR复合物的序列特异性识别，提供了额外的特异性层次[15]。该技术在植物病原体诊断（包括真菌、细菌和病毒）方面展现了巨大潜力[16]。 尽管有多种分子检测技术可供选择，但针对M. oryzae

材料与试剂

本研究使用M. oryzae MOK1菌株（NCBI登录号PP027921）作为参考菌株。LbCas12a核酸酶和10 NEBuffer 2.1购自New England Biolabs（北京，中国）。重组酶聚合酶扩增（RPA）试剂盒来自TwistDx（英国Maidenhead）。Bst DNA聚合酶和ThermoPol?反应缓冲液购自New England Biolabs（北京，中国）。2X PCR Master Mix购自Takara Bio Inc.（大连，中国），SYBR Green qPCR Master Mix也来自该公司。

常规PCR和qPCR

常规PCR的灵敏度分析显示，可见的扩增产物表明其检测限可达到10⁶拷贝/反应（图1a）。在此稀释度以下（10⁵拷贝/反应及更低浓度）未观察到扩增现象。相比之下，qPCR表现出更高的灵敏度，能够持续检测到低至10³拷贝/反应的病原体，其荧光曲线对应的目标DNA稀释范围为10⁹至10³拷贝/反应（图1c）。

讨论

准确检测Magnaporthe oryzae对于及时干预和疾病控制至关重要。本研究评估了六种分子检测技术，包括常规PCR、qPCR、RPA、LAMP以及结合RPA或LAMP的CRISPR-Cas12a，并将其与先前报道的检测方法进行对比，以了解它们在灵敏度、特异性和适用性方面的表现。 本研究的一个独特之处在于使用Pot2转座子作为分子检测目标。

结论

本研究首次使用相同的引物集，对常规、等温和基于CRISPR的M. oryzae检测方法进行了统一、并列的比较，这些引物集针对多拷贝的Pot2转座子。所评估的方法中，结合LAMP或RPA的CRISPR-Cas12a检测方法的灵敏度最高，能够检测到低至1拷贝/反应的病原体。

伦理批准声明

本研究无需伦理批准，因为它不涉及人类参与者、动物或敏感数据。

资助

作者们未获得任何外部资助用于这项研究。

CRediT作者贡献声明

R. Karan：概念提出、数据整理、数据分析、方法设计、撰写初稿。 M.K. Prasannakumar：概念提出、数据整理、数据分析、资金筹集、方法设计、项目管理、撰写及修订。 Harvinder Kour Khera：概念提出、数据整理、数据分析、资金筹集、方法设计、撰写及修订。 J. Harish：数据整理、数据分析、撰写及修订。 Swathi S. Patil：

利益冲突声明

H.K. Khera、M.K. Prasannakumar、R. Karan和R.K. Mishra是与本工作相关的专利的发明人，专利申请号为202541028218。其他作者声明没有可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

我们衷心感谢班加罗尔GKVK大学植物病理学系PathoGenomics实验室和班加罗尔Tata遗传学与社会研究所的支持与资源提供。同时，也非常感谢Jawaharlal Nehru Memorial Fund (JNMF)奖学金对R. Karan的资助。