《Analytica Chimica Acta》：Therapeutic oligonucleotide (nusinersen) metabolism in cerebrospinal fluid samples of patients with spinal muscular atrophy based on liquid chromatography coupled with mass spectrometry data
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脊髓性肌萎缩症（SMA）患者应用Spinraza（含Nusinersen）治疗后，通过开发液液/固相萃取结合离子对RP超高效液相色谱-质谱联用新方法，首次系统鉴定了CSF中Nusinersen代谢物（主要为3'外切酶解生成的N-shortmers），发现患者间代谢特征存在显著差异，为药效关联研究奠定基础。
Sylwia Studzińska|Anna Lemska|Jakub Szymarek|Maria Mazurkiewicz-Be?dzińska
托伦尼古拉·哥白尼大学化学系环境化学与生物分析学教授，波兰托伦Gagarin街7号，邮编87-100
摘要
背景
脊髓性肌萎缩症（SMA）是一种严重的遗传性神经肌肉疾病，由运动神经元存活蛋白的缺乏引起。反义寡核苷酸疗法的引入显著改善了患者的预后，尤其是随着Nusinersen（Spinraza）这一首个SMA治疗药物的获批。尽管Nusinersen经过2′-O-甲氧乙基和磷硫酯基团的修饰，但它仍会在体内代谢。由于反义寡核苷酸的分析挑战，对其在脑脊液（CSF）中的代谢产物的全面表征仍然有限。本研究旨在开发一种液-液/固相萃取方法，并结合离子对超高性能液相色谱（IP RP HPLC）与质谱（MS）技术，用于从接受Spinraza治疗的SMA患者脑脊液样本中提取、分离和鉴定Nusinersen及其代谢产物。
结果
两步样品制备程序实现了高回收率（89.2±1.8%），具有重复性，消除了基质效应，并能使样品浓度提高50倍。这些对于检测和鉴定给药四个月后低丰度代谢产物至关重要。可靠的代谢产物鉴定需要足够的色谱分辨率，尤其是对于那些仅相差一个核苷酸但m/z值相似的代谢产物。因此，仔细选择离子对试剂和优化质谱条件对于提高分离效果和检测低丰度代谢产物的敏感性至关重要。实验结果表明，丙胺和二甲基丁胺可以互换使用，但后者具有更高的分辨率。准确的质谱测量以及来自甲基化核碱基和磷硫酯基团的特征碎片离子确保了可靠的鉴定结果。对17名处于不同给药阶段的儿科SMA患者脑脊液样本的分析显示，Nusinersen在体内广泛代谢，主要通过3′-外显子核酸酶切割途径生成多种短片段代谢物。这是首次观察到不同患者间Nusinersen及其代谢产物谱型的差异。
意义
据我们所知，这是首批全面展示所开发方法适用性的研究之一，该方法可用于观察Nusinersen代谢的差异，并在未来将其与治疗效果、治疗监测或患者状况联系起来。该方法解决了关键的生物分析挑战（重现性、纯化、浓缩、分离），并能够在复杂的生物基质中进行代谢产物分析。此外，它为未来研究代谢、药物暴露和SMA治疗中的临床反应之间的关联奠定了基础。
引言
脊髓性肌萎缩症（SMA）是一种罕见的遗传性疾病，由运动神经元存活蛋白（SMN）的缺乏引起，最常见的原因是SMN1基因突变[1]、[2]。在2016年之前，由于肌肉无力或萎缩（导致运动、吞咽和呼吸困难），该病通常是致命的。反义寡核苷酸（ASO）疗法的引入显著改善了患者的预后[2]。Nusinersen是Spinraza中的活性成分，是首个获批的SMA疾病修饰治疗药物，目前广泛应用于儿童和成人患者[1]、[2]、[3]。Nusinersen是一种经过2′-O-甲氧乙基和磷硫酯基团修饰的寡核苷酸，旨在增强SMN的生物合成效率[1]、[4]、[5]。核糖部分、磷酸骨架和嘧啶碱基的结构修饰显著降低了核酸酶的降解并延长了生物活性[6]。然而，尽管具有稳定性，Nusinersen在体内仍会发生代谢，主要通过3′端的外显子核酸酶切割，产生截短代谢物（N-短片段）[6]、[7]。了解Nusinersen在脑脊液中的代谢情况对于其全面的药代动力学表征至关重要，这也有助于理解患者间治疗反应的差异。因此，开发用于分析Nusinersen代谢产物的方法非常重要[3]、[5]、[8]。然而，由于其高极性、易发生非特异性吸附以及在生物基质中浓度较低，ASO的生物分析仍然具有挑战性[9]、[10]、[11]。
迄今为止，一些研究使用基于杂交的免疫测定法（如杂交核酸酶酶联免疫吸附测定法ELISA）或电化学发光方法[1]来定量血清和脑脊液中的Nusinersen浓度。虽然这些方法灵敏度较高，但无法提供结构信息，因此不适合用于代谢产物鉴定。相比之下，液相色谱与质谱联用（LC-MS）能够同时检测和表征ASO及其代谢产物[9]、[10]。该方法已用于分析给药后脑脊液中的蛋白质组[12]，或用于测定脑脊液样本中的Nusinersen本身[3]、[5]、[7]、[8]。离子对超高性能液相色谱（IP RP HPLC）与质谱联用具有优异的保留能力、高灵敏度（定量下限为2-5 ng/mL）[3]、[4]、[5]。目前Nusinersen分析中存在的问题包括内标选择（同位素标记内标价格昂贵）[3]、[5]、使用同源寡核苷酸（如dT20）[3]、[5]以及携带效应（通过提高柱温、增加流速、多次梯度循环或调整流动相pH值可降低携带效应）[5]、[8]。尽管IP RP UHPLC MS已成为ASO分析的强大平台，但也使用了亲水相互作用液相色谱[8]。不过，亲水相互作用液相色谱的灵敏度较低（30 ng/mL）[8]。当流动相pH值低于4时，还会观察到Nusinersen的非特异性吸附[8]。另一种有趣的方法是使用修饰有单链结合蛋白的磁性纳米颗粒，这些纳米颗粒能与荧光量子点结合[13]。该方法对Nusinersen具有非常高的特异性和灵敏度（检测限为0.03 nM），但对代谢产物则不适用[13]。
目前已有两种方法从血浆或脑脊液（大鼠、兔子）中提取Nusinersen：一种方法是使用0.01%的三乙胺在甲醇或乙腈中沉淀蛋白质，但这并非ASO分析的常规方法[5]；另一种方法是固相萃取（SPE），但在Nusinersen提取中未提供关于回收率或基质效应的信息[3]、[8]。SPE更常用于ASO的提取[3]、[8]。在从血浆和脑脊液中提取Nusinersen时使用了两种不同的SPE柱：Clarity? OTX和Oasis HLB，前者回收率为93-96%，后者为67-75%[4]、[8]。
尽管有多项研究关注血浆或脑脊液中Nusinersen的定量，但描述从SMA患者脑脊液样本中全面提取、色谱分离和鉴定Nusinersen代谢产物的报道仍然较少[14]。有关Nusinersen代谢产物的研究较多[7]、[15]，但更多出版物集中在基因表达调节[16]、脑脊液中生化成分（葡萄糖、蛋白质）的变化[17]，以及依赖于Nusinersen治疗的脑脊液多蛋白质组分析[18]上。此外，一些小分子代谢产物被证实能预测Nusinersen的疗效（如1-丙烯酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸、N-肉豆蔻酰精氨酸、1,1,1,2,2-五氟-7-苯基庚烷-3-酮[19]。本研究旨在开发一种稳健的LLE/SPE IP-RP-UHPLC-Q-TOF-MS工作流程，用于从接受Spinraza治疗的SMA患者脑脊液样本中提取、分离和鉴定Nusinersen及其代谢产物。特别强调了色谱和质谱条件的优化，以及截短代谢产物的可靠区分。通过将这种方法应用于临床样本，我们试图表征Nusinersen在体内的代谢谱型，并探索该技术在理解中枢神经系统治疗寡核苷酸代谢方面的潜力。据我们所知，这是此类研究中的首批之一。
材料与方法
LC-MS级水、N-己胺（HA）、N,N-二甲基丁胺（DMBA）、N-丙胺（PA）、N,N-二乙胺（DEA）、N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）、1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇（HFIP）购自Merck（波兰华沙）。LC-MS级甲醇（MeOH）购自Honeywell。去离子水由Milli-Q系统（Millipore，美国埃尔帕索）提供。酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）混合物（饱和10 mM Tris，pH 8.0，1 mM EDTA）也购自Merck（华沙）。
结果与讨论
开发一种稳健的方法来提取、分离和鉴定SMA患儿脑脊液样本中的Nusinersen代谢产物，对于多个相关的药理学、生物分析和医学领域至关重要。没有特定的代谢产物分析工具，就无法全面了解这种寡核苷酸在中枢神经系统中的代谢情况。这对于准确的药代动力学和药效学解释至关重要。
结论
成功开发了一种全面的分析方法，用于从接受Spinraza治疗的SMA患儿脑脊液样本中提取、分离和鉴定Nusinersen代谢产物。据我们所知，这是首次证明LLE/SPE和IP RP UHPLC Q-TOF-MS适用于实际脑脊液样本中Nusinersen代谢研究的研究。Nusinersen在各种储存和冻融条件下表现出相对较高的物理化学稳定性，确保了样本结果的可靠性。
声明
样品的采集符合格但斯克医科大学的相关指南，并获得了格但斯克医科大学独立生物伦理委员会的批准（许可编号NKBBN/778/2022）。
CRediT作者贡献声明
Maria Mazurkiewicz-Be?dzińska：撰写、审稿与编辑。Jakub Szymarek：撰写、审稿与编辑。Anna Lemska：撰写、审稿与编辑。Sylwia Studzińska：撰写初稿、验证、项目管理、方法学设计、研究实施、资金申请、数据分析、数据管理、概念构思
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
作者感谢波兰克拉科夫的国家科学中心在Opus项目（2023/51/B/NZ7/00537）下的财政支持。
