从生长在苏打盐碱土壤中的油菜（Brassica napus）根际中分离得到的Billgrantia sp. C5P2菌株的基因组序列

《Microbiology Resource Announcements》：Genome sequence of Billgrantia sp. strain C5P2, isolated from the rhizosphere of Brassica napus grown in soda saline–alkaline soil

基因组测序与比较分析表明，分离自拟南芥根系钠盐碱性土壤的Billgrantia sp. strain C5P2具有4.76Mb的单一环状染色体，GC含量63.97%，其16S rRNA基因与Billgrantia desiderata高度相似（98.47%），但ani值（88.21%-89.38%）和dDDH值（36.3%-32.5%）均低于物种划分阈值，提示该菌株可能属于新物种。

　　

摘要

本文介绍了从盐碱土壤中Brassica napus的根际分离出的Billgrantia C5P2菌株的基因组序列。C5P2菌株的4.76 Mb基因组及其全基因组比较分析表明，它可能属于Billgrantia属中的一个独立物种。

公告

C5P2菌株是从在控制盆栽实验中培养的20天大的Brassica napus Huayouza 62品种的根际分离得到的。这些植物生长在由70%来自中国松嫩平原（黑龙江省）的盐碱土壤和30%商业培养基组成的混合土壤中。根际悬浮液经过系列稀释后，接种到添加了8%（重量/体积）NaCl（pH 8.5）的碱性Luria–Bertani（LB）琼脂平板上。平板在30°C下进行需氧培养24–48小时，通过反复划线分离出不同的菌落。进行基因组测序的目的是为了表征C5P2的基因组特征并明确其在Billgrantia属中的分类地位。

几乎全长的16S核糖体RNA（rRNA）基因使用通用细菌引物27F和1492R通过PCR扩增（1），并通过Sanger测序技术得到其序列（PX056828.1；1,375 bp）。该序列与EzBioCloud数据库（2）进行比对，显示出与Billgrantia desiderata FB2菌株最高的相似度（98.47%）。系统发育分析使用MEGA v12.0中的MUSCLE算法（3进行），并在Tamura–Nei模型下，结合伽马分布的变异率和不变位点（G+I），通过1,000次自助法重复实验构建了最大似然树（图1）。

图1

图1 基于16S核糖体RNA基因序列的最大似然系统发育树，显示了C5P2菌株在Halomonadaceae科中的位置。

为了提取基因组DNA，C5P2菌株在含有8%（重量/体积）NaCl（pH 8.5）的LB培养基中于30°C下进行需氧培养，并以180 rpm的速度振荡。培养12小时后，通过离心（8,000 × g，10分钟）收集细胞，然后使用Majorbio（上海）的磁珠细菌/真菌DNA提取试剂盒按照制造商的协议提取基因组DNA。

使用NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit（New England Biolabs）制备了一个Illumina双端文库（插入片段大小约为455 bp），并在Illumina HiSeq 4000平台上进行测序，生成2 × 150 bp的读段。共获得了8,056,216条原始配对读段。质量控制使用fastp v0.20.0（4）和默认参数进行，最终得到7,930,388条高质量读段。

高分子量DNA使用PacBio HiFi化学方法在Revio平台上进行单分子实时测序。DNA被切割成8–10 kb的片段（使用Covaris公司的G-tubes），并使用SMRTbell Prep Kit 3.0制备SMRTbell文库，无需额外的尺寸选择。测序产生了33,404条子读段（总长度369,263,678 bp），平均读段长度为11,112 bp。

基因组组装使用Unicycler v0.4.8（5）和默认参数完成，随后使用Pilon v1.22（6）和BWA-MEM v0.7.17（7）对Illumina读段进行修复。最终得到的基因组是一个环状染色体，长度为4,762,915 bp，鸟嘌呤-胞嘧啶（GC）含量为63.97%，平均测序深度为328倍。通过组装过程中重叠末端区域的解析确认了其环状结构。使用BUSCO v5.4.5（8）（细菌_odb10；完整性98.4%，碎片化1.6%）和CheckM v1.2.4（9）（完整性99.27%，污染率0.82%）评估了基因组的完整性。

基于基因组的亲缘关系通过平均核苷酸身份（ANI）进行评估，该身份使用JSpeciesWS中的ANIb和ANIm算法（10）基于BLAST计算，以及使用基因组间距离计算器v3.0（11）计算的数字DNA-DNA杂交（dDDH）值进行评估。最高的ANI值分别出现在Billgrantia bachuensis（88.21%/89.38%）和Billgrantia sulfidoxydans（86.74%/87.91%）之间，相应的dDDH值分别为36.3%和32.5%，均低于公认的物种阈值。这些结果表明C5P2菌株可能属于Billgrantia属中的一个独立物种。

使用美国国家生物技术信息中心（NCBI）的Prokaryotic Genome Annotation Pipeline（v6.10）（12）对基因组进行注释，鉴定出4,438个基因，其中包括4,336个蛋白质编码序列。使用antiSMASH v6.1.1（13）预测了次级代谢产物的生物合成基因簇，其中包括与铁载体相关的基因簇。

致谢

本研究在中国农业科学院研究生院（GSCAAS）进行，得到了国家自然科学基金（项目编号31370158和31570110）和GSCAAS中央公益性科学机构基础研究基金（项目编号1610042025005）的支持。S.L.M.P.还获得了中国奖学金委员会（CSC）的资助。

作者感谢Diego Armando Andrade和Andrés Manuel Mohali在手稿审阅过程中提供的帮助和宝贵意见。同时，作者也感谢Danielle Neal和Marina Antonieta Perdomo在文章处理费用方面给予的支持。