《Microbiology Resource Announcements》：Draft genomes of two Escherichia marmotae strains isolated from animal feces from a grain field in Germany
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埃希氏菌属新物种灰鼠狐猴埃希氏菌（2015年发现）的两个菌株分离自德国小麦田动物粪便，完成基因组测序及抗生素敏感性分析，发现对测试药物均敏感，MLST分型为ST5600和ST7630，与2016-2020年德国研究中的菌株亲缘关系较近，证实野生动物为天然宿主，但需进一步评估粮食污染风险及人畜共患病潜在威胁。
摘要
埃希氏菌属的Escherichia marmotae物种于2015年被新命名。自那时起，仅从不同动物物种或人类身上分离出少数该菌株。此外，该物种还表现出对抗生素的耐药性。本文介绍了从粮田中收集的动物粪便中提取的两种E. marmotae菌株的基因组草图。
公告
Escherichia marmotae最初于2015年从
Marmota himalayana的粪便中分离出来（
1）。随后，从老鼠、小鼠或牛等动物（
2–4）以及环境来源（
5）中又分离出了更多
E. marmotae菌株。此外，还从有轻度至重度症状的临床病例中获得了该菌株（
6–9），这表明
E. marmotae可能是一种人畜共通病原体。对某些菌株的基因组分析显示，该物种出现了抗菌素耐药基因（
4,
7）。
在我们的研究中，我们分析了从德国小麦田中收集的野生动物粪便，以确定可能污染谷物及其后续面粉加工过程的来源。粪便样本于2025年2月在田地施肥前被分别收集到50毫升的Falcon试管中，并储存在4°C条件下待进一步处理。将1克粪便样本接种到9毫升的缓冲蛋白胨水中，在37°C和175转/分钟的旋转培养箱中培养。取10微升过夜培养物涂布在添加了100微克/毫升氨苄西林的MacConkey琼脂平板上（Merck，达姆施塔特，德国），并在37°C下培养24小时。通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS，Bruker Daltonics，不来梅，德国）鉴定出两个不同粪便样本中的
Escherichia marmotae菌株。使用商业EUVSEC3微孔板（Sensititre，Thermo Fisher Scientific）进行了抗菌素敏感性测试，所使用的抗菌物质列在
表1中，浓度范围和流行病学临界值依据欧盟委员会实施决定2020/1729/EU（
10）和欧洲抗菌素敏感性测试委员会（EUCAST）（
11）。基因组DNA使用PureLink Genomic DNA Mini Kit（Thermo Fisher Scientific，美国）提取。使用Illumina DNA Prep (M) Tagmentation Kit（Illumina，圣地亚哥，美国）制备文库，并在NextSeq500台式测序仪上使用NextSeq 500/550 midoutput kit v2.5（300循环，2 × 149 bp双端测序）进行测序。原始读段通过AQUAMIS pipeline v1.4.2（
https://gitlab.com/bfr_bioinformatics/AQUAMIS/）进行修剪和
de novo组装，其中修剪使用fastp v0.23.2（
12），组装使用shovill v1.1.0（
https://github.com/tseemann/shovill，基于Spades）。AQUAMIS pipeline还包括quast v5.2.0用于组装质量控制（
https://github.com/ablab/quast）。菌株特征分析使用BakCharak pipeline v3.1.6（
https://gitlab.com/bfr_bioinformatics/bakcharak）进行，包括多基因座序列分型（MLST，
https://github.com/tseemann/mlst）和基于NCBI AMRFinder的抗菌素耐药性（AMR）分型（
13）。DNA分离和测序试剂盒的使用遵循制造商的说明。
表1 两种E. marmotae菌株的基因组测序结果和菌株特征| 特征 | BfR-EC-20803 | BfR-EC-20804 |
|---|
| 样本编号 | 25-EC00288 | 25-EC00289 |
| 序列ID | 25-EC00288-3 | 25-EC00289-2 |
| BioSample访问号 | SAMN51305455 | SAMN51305456 |
| SRA访问号 | SRR35386461 | SRR35386460 |
| GenBank编号 | JBSGOV000000000 | JBSGOW000000000 |
| 读段数量 | 2,487,212 | 2,722,057 |
| contig数量 | 101 | 109 |
| Q30碱基比例 | 0.870 | 0.869 |
| 覆盖深度 | 76.8 | 85.5 |
| N50（bp） | 153,262 | 161,021 |
| 总基因组长度（bp） | 4,712,503 | 4,624,491 |
| GC含量（%） | 50.29 | 50.38 |
| MLST分型 | ST5600 | ST7630 |
| 抗菌素敏感性 | | |
| ?AK（4–128 mg/L） | ≤4 | ≤4 |
| ?AMP（1–32 mg/L） | 2 | 4 |
| ?AZI（2–64 mg/L） | ≤2 | ≤2 |
| ?FOT（0.25–4 mg/L） | ≤0.25 | ≤0.25 |
| ?TAZ（0.25–8 mg/L） | 0.50.5 |
| ?CHL（8–64 mg/L） | ≤8≤8 |
| ?CIP（0.015–8 mg/L） | ≤0.015≤0.015 |
| ?COL（1–16 mg/L） | ≤1≤1 |
| ?GEN（0.5–16 mg/L） | 11 |
| ?MERO（0.03–16 mg/L） | ≤0.03≤0.03 |
| ?NAL（4–64 mg/L） | ≤4≤4 |
| ?SMX（8–512 mg/L） | ≤8≤8 |
| ?TET（2–32 mg/L） | ≤2≤2 |
| ?TGC（0.25–8 mg/L） | ≤0.25≤0.25 |
| ?TMP（0.25–16 mg/L） | ≤0.25≤0.25 |
a
对这些菌株测试了以下抗菌物质：阿米卡星（AK）、氨苄西林（AMP）、阿奇霉素（AZI）、头孢噻肟（FOT）、头孢他啶（TAZ）、氯霉素（CHL）、环丙沙星（CIP）、多粘菌素（COL）、庆大霉素（GEN）、美罗培南（MERO）、萘啶酸（NAL）、磺胺甲噁唑（SMX）、四环素（TET）、替加环素（TGC）和甲氧苄啶（TMP）。
这些菌株分别被归类为MLST ST5600和ST7630（
表1），它们曾在2016至2020年间德国的一项更大规模研究中被鉴定（
14），该研究涵盖了从动物和食物中分离出的
E. marmotae菌株。使用Ridom SeqSphere软件v10.5.0（2025-03）中的
大肠杆菌核心基因组多基因座序列分型（cgMLST）工具将这些菌株与之前的研究结果进行了比较（
图1），结果显示ST7630菌株之间的亲缘关系更密切。抗菌素敏感性测试表明，这两种菌株对所有测试的抗菌物质均敏感，这与基因组数据一致，因为未检测到任何遗传性的抗菌素耐药性决定因子。我们的发现表明，野生动物是
E. marmotae菌株的自然宿主。然而，需要进一步研究
E. marmotae菌株通过粪便污染谷物及其后续面粉加工过程的可能性，以及这种污染是否可能导致人类感染。
图1 新从小麦田中分离出的E. marmotae菌株（红色圆圈）与参考文献14中的E. marmotae菌株的最小生成树（MST）对比图。MST使用Ridom SeqSphere软件v10.5.0（2025-03）和Enterobase cgMLST方案计算，包含2,513个基因座。颜色突出显示了相应的MLST分型；红色圆圈代表本研究中新分离出的两个菌株。致谢
我们感谢Annica Seemann、Kathrin Oelgeschlaeger和Tim Neumann在实验室和样本收集过程中的技术支持。
本研究得到了德国联邦风险评估研究所（BfR）（项目编号1332-821）的支持。
