一种pH/ROS双重响应的金属-多酚-抗生素纳米组装体，用于克服生物膜和细胞膜屏障，以对抗持续性感染

《Biomaterials》：A pH/ROS dual-responsive metal-polyphenol-antibiotic nano-assembly for combating persistent infection by overcoming biofilm and cell membrane barriers

本工作设计了一种Zn2?-鞣酸-米诺环素（ZTM）纳米平台，通过破坏生物膜、清除胞内细菌及调节NF-κB信号通路抑制炎症，有效治疗持续性感染并促进牙周组织再生。

　　

杜静|张群|王铮|金玉佳|高飞|孔颖|阿尔贝托·比安科|葛少华|马宝金

山东大学齐鲁医学院口腔科学与医院牙周病与组织工程与再生及医疗保健系，山东省口腔组织再生重点实验室，山东省牙科材料与口腔组织再生工程研究中心，山东省口腔疾病临床研究中心，济南250012，中国

摘要

持续性感染极难根除，主要原因是生物膜的形成和细菌在细胞内的定植，这些因素阻碍了抗菌剂的作用，降低了治疗效果，并导致感染复发。感染引起的炎症进一步破坏了组织稳态，阻碍了愈合过程。为了解决这些问题，我们通过一步自组装Zn²⁺、单宁酸（TA）和米诺环素（MC）制备了具有生物相容性的ZTM纳米颗粒（ZTM NPs）。与传统载体不同，这种共组装策略利用金属-酚类配位、氢键和π–π堆叠相互作用实现了高药物负载量，从而使米诺环素直接整合到动态的Zn²⁺-TA网络中。值得注意的是，构建的ZTM NPs对感染微环境中常见的酸性pH值和升高的活性氧（ROS）水平具有双重响应特性。在功能上，ZTM NPs能有效破坏细胞外聚合物（EPS），穿透生物膜屏障，并清除嵌入其中的细菌。此外，它们能够穿过细胞膜屏障，促进细胞内有效吸收。一旦进入细胞内，这些纳米颗粒会促进溶酶体逃逸，将活性成分释放到细胞质中，从而有效消灭细胞内细菌。除了抗菌作用外，ZTM NPs还能通过清除ROS、抑制NF-κB信号通路和抑制M1型巨噬细胞极化来调节免疫系统，从而减轻炎症并恢复组织稳态。体内实验表明，它们具有显著的抗菌和免疫调节效果，能够促进牙周组织再生。总体而言，ZTM NPs是一种能够同时实现生物膜破坏、细胞内细菌清除和免疫调节的临床可转化纳米平台。

引言

细菌性传染病对人类健康构成了持续威胁，每年导致数百万例严重疾病和死亡。[1],[2],[3]通常，当细菌在宿主体内定植后，会大量产生细胞外聚合物（EPS），这些物质有助于细菌形成致密的生物膜。[4],[5]与浮游细菌相比，生物膜对抗生素和恶劣宿主环境的耐受性更强。[6]令人担忧的是，在生物膜的保护下，某些致病菌可以侵入宿主细胞并利用细胞内环境获得额外保护。[7],[8],[9]这些细菌可以通过免疫逃逸在宿主细胞内长期存活，从而增加慢性炎症甚至感染复发的风险。[10],[11]除了外科干预外，抗生素仍然是临床治疗细菌感染的主要手段。然而，抗生素通常无法有效穿透细菌生物膜或进入细胞，[12],[13]这导致抗生素无法达到有效浓度，从而降低了其杀菌效果。因此，突破生物膜和细胞膜的屏障可能是提高抗生素疗效的关键。

为了应对细菌入侵，宿主细胞会激活多种补偿机制，包括增强氧化应激和抑制炎症级联反应，以限制感染的扩散。[14],[15]然而，如牙周炎和糖尿病感染伤口等持续性感染会导致过度炎症和组织损伤。活性氧（ROS）的过度产生会对蛋白质、脂质和核酸造成氧化损伤，导致细胞膜功能障碍和炎症加剧。[16],[17]此外，促炎细胞因子和免疫介质会加重组织损伤，进一步促进慢性炎症的发展。[18],[19]TNF/NF-κB信号通路在过度炎症中起关键作用，可被脂多糖（LPS）和ROS触发。[20]目前调节TNF/NF-κB信号通路的常见方法主要是单一模式（例如仅抑制NF-κB通路），难以取得理想效果。A20（也称为TNFα诱导蛋白3，TNFAIP3）是一种具有多效表达的细胞质信号蛋白，以其抗炎作用和抑制TNF及NF-κB信号通路的功能而闻名。[21]因此，基于感染控制、ROS清除和增强A20的TNF/NF-κB信号通路抑制的多模式协同作用可能是提高抗炎效果的有效策略。

工程化的抗生素纳米系统因其在破坏生物膜和杀死细胞内细菌方面的高效性而受到广泛关注。[3],[13],[22]其中，金属-酚类纳米材料由于其动态的金属-配体配位、结构可调性和内在生物活性而成为一类有前景的抗菌平台。[23],[24],[25]然而，大多数现有的基于纳米载体的策略仍存在药物负载量有限和刺激响应释放控制不足的问题。更重要的是，它们往往忽略了同时调节感染相关的氧化应激和过度炎症，而这些因素是有效组织修复的关键障碍。[26],[27],[28],[29]分子/离子的自组装可以显著提高药物负载量，并通常能够根据感染微环境（pH值或ROS）实现可控释放。在多价配位和协同非共价相互作用形成交联网络的系统中，药物分子可以结构性地整合到组装框架中，而不仅仅是吸附在表面，从而显著提高负载效率。基于金属离子、多酚和抗生素的自组装，我们设计了一种由Zn²⁺、单宁酸（TA）和米诺环素（MC）组成的多功能纳米颗粒（ZTM NPs），用于治疗持续性细菌感染和减轻过度炎症（图1）。这些ZTM NPs具有高度生物相容性，具有pH/ROS双重响应释放特性，并可通过溶酶体介导的内吞作用进入细胞，突破细胞膜的屏障。有趣的是，TA的多酚介导的“质子海绵”效应可以破坏溶酶体膜，促进活性成分的释放，增强TA、MC和Zn²⁺的细胞内递送。因此，ZTM NPs能够有效杀死细胞内细菌并缓解细胞内氧化应激。此外，TA还能通过减少EPS来抑制生物膜形成，从而提高ZTM NPs的生物膜清除效率。重要的是，ZTM NPs通过基于感染控制、ROS清除和增强A20的TNF/NF-κB信号通路抑制的多模式组合，显著减轻了LPS引起的过度炎症。体内实验进一步证实，ZTM NPs能够抑制持续性细菌感染和过度炎症，在牙周炎模型中实现了满意的组织再生。

ZTM NPs的特性

ZTM NPs是通过一步自组装策略制备的，如图1A所示。在此过程中，建立平衡的相互作用对于确保系统的稳定性至关重要。通过使用不同浓度的米诺环素水溶液，我们制备了一系列ZTM NPs（图S1A和B）。经过三次洗涤后，ZTM1的上清液无色，而ZTM2仍保留轻微的黄色。

结论

总结来说，我们开发了一种一步自组装方法来合成多功能ZTM NPs，用于对抗包括由P. gingivalis引起的牙周炎在内的细菌性传染病。这些纳米颗粒增强了抗生素的效果，有效解决了两种常见的持续性细菌感染问题：生物膜和细胞内细菌侵袭。具体而言，ZTM NPs在体外和体内均表现出良好的生物安全性，并能破坏EPS并穿透生物膜。

材料

盐酸米诺环素和单宁酸购自Aladdin（上海，中国）。氢氧化钠和Zn（NO₃)₂·6H₂O购自Hushi（上海，中国）。胎牛血清（FBS）、Alpha Minimal Essential Medium（α-MEM）、Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）、胰蛋白酶（0.25%）和青霉素-链霉素购自Gibco（纽约州格兰德岛，美国）。CCK-8购自Elabscience（武汉，中国）。SYTO9/PI荧光核酸染色剂购自Invitrogen

CRediT作者贡献声明

孔颖：验证、方法学。高飞：验证、方法学。金玉佳：方法学、实验研究。王铮：验证、方法学。张群：可视化、验证、方法学、实验研究。杜静：撰写-审稿与编辑、撰写-初稿、可视化、验证、项目管理、方法学、实验研究、概念构思。马宝金：撰写-审稿与编辑、监督、资源调配、项目管理、资金获取。葛少华：

利益冲突声明

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号：82471030、52373145、32301207）、山东省“泰山学者”工程专项基金（编号：tsqn202211327和tsqn202306370）、山东省重点研发计划（编号：2022CXGC020511）、山东省自然科学基金（编号：ZR2023QH499）以及国家临床重点专科（牙周病学）建设项目的支持。部分工作还得到了