用于修复肌肉骨骼创伤的自组装介孔生物玻璃多酚纳米酶

《Biomaterials》：Self-assembled Mesoporous Bioglass Polyphenol Nanozymes for Repairing Musculoskeletal Trauma

骨-肌肉联合再生治疗与纳米酶技术。CuMBG-PA纳米酶通过自组装形成稳定多酚网络，增强抗氧化能力及骨肌肉协同再生效果，单细胞测序揭示Prg4+前成骨细胞调控纤维连接蛋白和IGF表达，激活PI3K/AKT等通路，抑制纤维化促进功能恢复。

　　

赵绍|金叶生|贾志豪|顾荣照|马艳霞|张一格|赵一文|李珂|徐勇|丁文革

苏州大学第三附属医院创伤骨科，中国常州213003

摘要

体积性肌肉骨骼损伤（VMST）的特点是肌肉组织大量丢失并伴有骨骼损伤，这对再生医学提出了重大挑战。目前的疗法主要侧重于肌肉或骨骼的单独再生，但缺乏系统性和综合性的治疗策略。在这项研究中，我们开发了一种基于介孔生物活性玻璃（MBG）和原花青素（PA）的铜掺杂纳米酶CuMBG-PA，用于VMST的肌肉和骨骼联合修复。CuMBG-PA通过Cu-PA配位键自组装成稳定的多酚网络，增强了PA的稳定性和清除活性氧的能力。体外和体内实验表明，CuMBG-PA促进了骨生成和肌生成，同时表现出良好的生物相容性和抗菌活性。单细胞RNA测序结果显示，CuMBG-PA通过多种肌肉骨骼共有的代谢途径协同诱导干细胞分化并促进组织修复。其机制在于CuMBG-PA增加了蛋白聚糖4（Prg4+）纤维/脂肪生成前体细胞（FAPs）的数量，这些细胞高度表达纤维连接蛋白和胰岛素样生长因子。此外，Prg4还能调节免疫细胞，清除过度激活的肌肉卫星细胞，减少肌肉纤维化，并在再生过程中促进功能恢复。总之，这种新型自组装的CuMBG-PA纳米酶为VMST的肌肉和骨骼联合修复提供了一种潜在的生物材料策略。

引言

创伤，尤其是多系统肌肉和骨骼损伤，占全球死亡人数的10%和残疾病例的16%。体积性肌肉骨骼损伤（VMST）的特点是广泛的肌肉缺陷并伴有骨骼破坏，是一种特别严重和复杂的创伤形式，对患者具有严重的临床和功能影响[1]、[2]。VMST常见于严重的开放性骨折[3]和代谢性疾病[4]中。由于多种病理因素破坏了再生环境，包括显著的组织丢失[5]、血管生成受损[6]和微环境紊乱[7]，因此VMST的修复极具挑战性。在这些因素的共同作用下，骨骼代谢受到干扰，肌肉再生受阻，整体再生能力下降。这不仅限制了患者的日常活动能力，还可能引发长期的生理和心理负担，从而给公共卫生带来巨大经济压力[8]。

鉴于VMST复杂的病理生理学特性，充分理解肌肉和骨骼之间的相互作用对于制定有效的治疗方案至关重要。肌肉和骨骼之间存在复杂的双向调控机制，为VMST中骨骼和软组织的联合修复提供了重要的理论基础。肌肉可以通过分泌细胞因子[9]参与骨骼代谢和修复，同时也可以作为骨骼再生的干细胞来源。肌肉组织的间充质干细胞能够迁移到骨折部位并参与软骨和骨骼的形成[10]。另一方面，骨骼可以通过分泌生长信号和其他信号分子[11]调节肌肉干细胞的激活和分化。此外，肌肉和骨骼之间存在生物力学相互作用，肌肉可以通过机械负荷刺激骨骼生长和重塑[12]。肌肉和骨骼还共享多种代谢调控途径，如PI3K/Akt途径和细胞外基质诱导的信号途径。因此，针对促进肌肉和骨骼协调修复的目标具有潜在的治疗意义。生物材料的进步重新激发了人们对联合组织修复的兴趣[13]、[14]。然而，能够促进肌肉和骨骼协调修复的双靶点材料的研究仍然相对有限。介孔生物活性玻璃（MBG）因其出色的骨骼和软组织再生能力而受到广泛关注[15]、[16]、[17]。MBG具有较大的比表面积和孔体积，可以显著提高药物装载效率，是一种有前景的肌肉和骨骼联合修复生物材料。此外，通过掺入金属离子（如铜离子），MBG在骨生成、抗菌性能和血管生成方面得到进一步增强，拓宽了其临床应用范围[18]、[19]。

原花青素（PA）是一类从植物中提取的多酚化合物，分子式为C₃₀H₂₆O₁₃。由于其强大的抗氧化作用、组织再生潜力和广泛的抗菌活性，它在治疗VMST方面具有潜力。研究表明，PA作为一种强效抗氧化剂，能够有效清除自由基[20]，并通过增强细胞内抗氧化酶的活性[21]进一步提高细胞的抗氧化能力，从而有效保护细胞免受氧化应激的损害。此外，PA在促进组织再生方面也显示出显著潜力。研究发现，PA可以通过增强胶原纤维内的矿化[22]、激活Wnt/β-连环蛋白信号通路[23]、[24]以及抑制NF-κB信号通路[25]来促进骨生成分化。PA还可以抑制RANKL诱导的破骨细胞分化和骨吸收，从而增加骨密度和强度[26]。PA可以通过上调miR-133b来促进缺血性骨骼肌的再生，进而激活p38-MAPK信号通路，诱导肌肉卫星细胞的分化和肌管的形成[27]。PA还具有抗菌作用，通过改变细菌细胞膜的通透性导致细胞内容物泄漏，有效抑制大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和链球菌（Streptococcus spp.）等病原体[28]、[29]。然而，尽管具有这些优良特性，原花青素稳定性较差，易受环境因素影响，在体内代谢迅速，难以长时间保持其生物活性。这些缺点在VMST复杂的病理生理学背景下尤为突出，因为单体PA无法应对多因素挑战。

我们的研究表明，MBG产生的弱碱性环境可以诱导PA自交联成聚合物。在没有外加交联剂的情况下，这些聚合物可以与MBG释放的金属离子螯合并自组装成CuMBG-PA生物纳米酶。具体机制如下：MBG中的金属离子（如Cu²⁺和Ca²⁺）可以与周围溶液中的H⁺或H₃O⁺发生离子交换。同时，硅以Si(OH)4的形式释放到溶液中，使MBG表面富含羟基（OH^-）。这一过程提高了局部pH值，形成了碱性环境。在这种弱碱性环境中，原花青素中的酚羟基（Ar-OH）更容易去质子化，形成酚酸根离子（Ar-O^-）。在没有外加交联剂的情况下，这些酚酸根离子可以高效自交联成聚合物。随后，这些富含酚酸根离子的聚合物与MBG释放的金属离子螯合，并均匀吸附在介孔生物活性玻璃上，最终自组装成CuMBG-PA多酚纳米酶。

CuMBG-PA多酚纳米酶形成了高度有序的聚合物网络结构，使其具有更高的分子稳定性和对外部环境因素（如光和温度）的抵抗力。因此，其在复杂微环境中的降解抗性显著提高，从而延长了其生物活性持续时间。多酚聚合物的交联结构形成了密集的酚羟基网络，可以有效清除活性氧（ROS），实现持续高效的抗氧化作用。此外，我们发现CuMBG-PA多酚纳米酶显著增强了其诱导骨骼、肌肉组织和血管形成的能力。单细胞测序分析显示，CuMBG-PA诱导Prg4+ FAPs细胞上调纤维连接蛋白（FN1）和胰岛素样生长因子（IGF），进而激活PI3K/AKT、MAPK和ECM-受体等关键信号通路，实现高效的组织再生。这种分子级联反应可能代表了肌肉-骨骼组织协调修复的共有机制。此外，Prg4+ FAPs细胞分泌的Prg4表现出强大的抗纤维化作用，防止细胞外基质（ECM）过度沉积，促进肌肉再生和功能恢复。在肌肉-骨骼界面修复的背景下，这种机制为VMST疾病模型下的软组织和硬组织界面联合修复提供了一种新策略（图1）。

CuMBG-PA多酚纳米酶的特性

CuMBG-PA多酚纳米酶的制备和特性如图2A所示。首先，通过溶胶-凝胶法合成铜掺杂的MBG，然后与PA溶液自组装。PA富含酚羟基（Ar-OH），在CuMBG创造的弱碱性环境中发生自聚合形成原花青素聚合物。这些聚合物进一步与介孔生物活性玻璃释放的金属离子螯合，并均匀吸附在其表面

讨论

VMST的特点是肌肉组织大量丢失并伴有骨骼破坏。其再生环境受到多种不利因素的挑战，主要表现为大量组织丢失，尤其是干细胞和细胞基质的显著丧失，使身体缺乏修复所需的“土壤”。此外，还伴有血管生成受损和微环境紊乱。因此，促进干细胞的增殖和分化至关重要

结论

在这项研究中，我们开发了一种CuMBG-PA生物多酚纳米酶，用于促进VMST中的骨骼-肌肉联合修复。CuMBG-PA纳米酶通过自组装形成了高度有序的多酚网络结构，显著增强了分子稳定性，并克服了PA单体降解的问题。CuMBG-PA多酚生物纳米酶能够模拟SOD和GSH-Px的活性，实现高效的ROS清除。此外，其协同生物效应优于其他类似物质

CuBG的制备

CuBG是通过溶胶-凝胶法制备的。首先，将0.56克十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，≥97%，Sigma-Aldrich，美国）分散在26毫升去离子水中并搅拌。当表面活性剂完全溶解后，加入8毫升乙酸乙酯（≥99.8%，Sigma-Aldrich，美国）。搅拌30分钟后，逐滴加入5.6毫升1 M氨水（VWR）。接下来，加入2.88毫升正硅酸四乙酯（TEOS，≥99%，Sigma-Aldrich，美国）和1.83克硝酸钙四水合物（Ca(NO₃)₂·4H₂O，≥99.4%

CRediT作者贡献声明

丁文革：撰写 – 审稿与编辑，监督，概念构思。赵绍：撰写 – 原稿撰写，可视化，方法学，研究，概念构思。贾志豪：撰写 – 审稿与编辑，方法学，研究。金叶生：方法学，研究，概念构思。马艳霞：监督，方法学。顾荣照：撰写 – 原稿撰写，监督。赵一文：撰写 – 审稿与编辑，可视化。张一格：可视化，研究。徐勇：

数据可用性

数据可应要求提供。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号82072476）、江苏省自然科学基金（编号BK20230494）、姑苏创新创业领军人才项目（编号ZXL2023204）、国家高层次青年人才计划（编号KS24700124）、江苏省特聘教授计划（编号SR24700123）、江苏省高等教育机构重点学术发展计划（PAPD）以及教育部老年疾病与免疫学重点实验室的支持