一种快速且可即时应用的检测方法，利用LAMP技术针对特定小麦矮缩病毒进行检测

《Crop Protection》：A quick and on-the-spot applicable method for the strain-specific detection of wheat dwarf virus by LAMP technique

小麦 dwarf 病毒（WDV）分两大经济株系，需快速准确鉴别以控制病害传播。本研究开发并验证新型环介导等温扩增（LAMP）检测试剂盒，无需商业提取试剂盒，30-60分钟内区分WDV-W和WDV-B，灵敏度达传统PCR 10^4-10倍。现场测试表明，全流程可在1-2小时内完成，适用于野外实时监测和决策支持。

　　

博通德·宗博尔·佩尔蒂克斯（Botond Zsombor Pertics）|格莱戈里·托尔特（Gergely Tholt）|扬卡·西蒙（Janka Simon）|雷吉娜·格尔斯滕布兰德（Regina Gerstenbrand）|埃娃·西塔（éva Szita）|科内尔·格罗（Kornél Ger?）|费伦茨·萨穆（Ferenc Samu）

匈牙利农业研究HUN-REN中心，植物保护研究所，布达佩斯

摘要

小麦矮缩病毒（WDV）是一种主要的谷物病原体，包含两种具有经济重要性的毒株：WDV-小麦（WDV-W）和WDV-大麦（WDV-B）。快速且可靠地区分这两种毒株对于有效控制疾病至关重要。在本研究中，我们开发并验证了新型的、针对特定毒株的环介导等温扩增（LAMP）检测方法，可以直接从植物和媒介样本中检测WDV。

优化后的检测方法能够在30-60分钟内明确区分WDV-W和WDV-B，且无需使用商业提取试剂盒，仅需简单的煮沸法进行DNA制备。在实验室条件下，这两种引物对都具有高特异性，无交叉反应现象。敏感性测试显示，WDV-B的LAMP检测方法的灵敏度比传统PCR高10^4倍，而WDV-W的检测方法灵敏度则大约高10倍。

田间试验表明，包括样本制备、扩增和结果评估在内的整个流程可以在1-2小时内使用便携设备在现场完成，并且在实际环境条件下能够获得一致且可靠的结果。此外，我们还开发了一套实用的户外LAMP操作方案，并作为补充材料提供。

所提出的方法提供了一种快速、经济且无需提取的检测方法，能够在需要时准确识别特定毒株的WDV，具有支持田间监测、早期疾病检测和及时采取作物保护措施的巨大潜力。

引言

根据国际病毒分类委员会（ICTV）的最新分类，小麦矮缩病毒（WDV）属于Mastrevirus hordei属。该病毒最早由Vacke（1961年）描述，被认为是危害谷物作物最严重的病原体之一，在过去一个世纪中已在欧洲和亚洲多地发现（Abt等人，2019年；Wei等人，2024年）。典型症状包括叶片黄化、植株严重矮化、节间缩短（见图S1a-c），在严重情况下会导致穗部无法正常形成，从而使产量减少多达80%（Pfrieme等人，2023年）。小麦（Triticum aestivum）和大麦（Hordeum vulgare）是该病毒的主要宿主，但也有报道指出黑麦、燕麦以及多种野生草类也会被感染（Pfrieme等人，2023年）。该病毒的传播仅依赖于一种媒介——叶蝉Psammotettix alienus（Dahlbom，1850年），这种叶蝉能够持续携带病毒而不进行病毒复制（Lindblad & Sigvald，2004年）。

WDV的基因组为单链环状DNA，长度约为2.7 kb，包含运动蛋白（MP，V2）、包膜蛋白（CP，V1）以及与复制相关的蛋白（RepA，C1和Rep，C1:C2）（见图1）。这些编码区两侧是大片段和小片段的基因间区域（LIR，SIR），其中含有复制和转录信号（Pfrieme等人，2023年）。

传统的系统发育研究根据核苷酸序列差异和宿主特异性将WDV分为两个主要毒株：WDV-小麦毒株（WDV-W）和WDV-大麦毒株（WDV-B）（Commandeur & Huth，1999年；Trzmiel & Klejdysz，2018年；Pfrieme等人，2023年）。后续研究通过分析高度变异的基因间区域（LIR）中的多态性，进一步将WDV分为A-E五个亚毒株（Muhire等人，2013年），后来又增加了F亚毒株（Wu等人，2015年）。根据Wu等人（2015年）的分类方案（随后得到Pfrieme等人（2023年）的认可），A和F亚毒株属于WDV-大麦组，而B、C、D和E亚毒株属于WDV-小麦组。为保持清晰性，我们采用WDV-W和WDV-B这两个名称（遵循Pfrieme等人，2023年的定义）。我们将A-F亚毒株（Muhire等人，2013年；Wu等人，2015年）称为“亚毒株”而非“支系”（Pfrieme等人使用的术语，因为“支系”通常用于描述更高层次的群体分类，如Fauquet & Stanley，2005年；Roumagnac等人，2022年）。

准确识别和区分WDV毒株对于有效控制其传播至关重要。由于WDV能够感染多种宿主植物，形成了一个涉及栽培谷物和野生草本植物的动态感染循环，这使得WDV感染的复杂性进一步增加（Schubert等人，2007年；Wu等人，2015年；Pfrieme等人，2023年）。要绘制这一传播网络，需要了解每种宿主和当地媒介种群中存在的WDV毒株情况，因为虽然WDV-小麦毒株主要感染小麦，WDV-大麦毒株主要感染大麦，但偶尔也会出现交叉感染现象（Schubert等人，2002年；Abt等人，2019年）。此外，一些野生草本植物已成为这两种毒株的新宿主，可能成为长期的病毒储存库（Ripl & Kundu，2015年；Abt等人，2019年；Pouramini等人，2019年）。

可在田间使用的诊断方法，尤其是快速环介导等温扩增（LAMP），可以用于现场追踪这些特定毒株的感染情况。现场检测能够识别作物、野生宿主或媒介种群中的感染热点，从而指导更全面的分子分析。这类研究的积累可以为WDV毒株的进化与传播提供关键见解。将此类背景知识与可靠的田间诊断方法相结合，可以纳入常规监测体系，为农民提供及时的、可操作的信息，帮助他们调整播种日期、实施媒介控制或重新种植受影响的地块，并为区域性的病毒监测网络奠定基础，从而主动预防大规模的WDV爆发。

目前实验室中检测WDV的方法主要依赖于PCR、qPCR或ELISA，但环介导等温扩增（LAMP）提供了一种便携式的替代方案（Notomi等人，2000年）。LAMP使用Bst或Bsm DNA聚合酶，其链置换活性使得扩增可以在单一温度（57-65°C）下完成，因此无需使用热循环仪；只需一个由电池供电的加热器或保温瓶即可（Nkouawa等人，2012年）。反应在30-60分钟内完成，这对于时间敏感的现场检测非常有利（Panno等人，2020年；Zou等人，2020年；Shirshikov & Bespyatykh，2022年）。

结果可视化方式也非常多样。荧光或比色指示剂可以通过pH变化、镁焦磷酸盐沉淀或DNA浓度增加来显示扩增情况，而侧向流动条带则可以实现封闭管内的读数（Fischbach等人，2015年；Kusumawati等人，2015年；Miyamoto等人，2015年；Patel等人，2015年；Pang等人，2019年；Scott等人，2020年；Park，2022年）。

LAMP已在多种人类病原体检测中展现出其多功能性：例如SARS-CoV-2（Kellner等人，2021年）、分枝杆菌属（Garg等人，2021年）或乙型肝炎病毒（Nagamine等人，2001年）。在植物病原体检测方面，LAMP也取得了成功：例如从橡树中检测到Phytophthora ramorum（Tomlinson等人，2007年）、从土壤中检测到Rhizoctonia solani（Patel等人，2015年）、从燕麦中检测到大麦黄矮缩病毒（BYDV）（Zhao等人，2010年）、以及从番茄中检测到番茄黄叶卷曲病毒（TYLCV）（Dehabadi，2013年）。尽管在植物病毒检测中有许多应用（Panno等人，2020年），但只有三项研究将LAMP应用于WDV，这些研究仅能对小麦、大麦、小黑麦或媒介进行通用检测，而无法区分不同毒株（Trzmiel & Hasiow-Jaroszewska，2020年；?elik & Ferhan Morca，2021年；Hao等人，2021年）。此外，不同的研究采用了不同的方法，这些方法往往难以重复且难以获得可靠结果，因此迫切需要广泛适用且可重复的实验方案。

本研究旨在设计和验证能够快速、通用且能够区分特定毒株的LAMP引物组合。我们还比较和优化了已报道的LAMP方案，以选择最适合和最可靠的方案用于WDV检测。最终目标是创建一种经济高效、适用于田间的稳健方案，能够在现场区分WDV-W和WDV-B，从而支持实时监测、有根据的媒介控制和及时的作物管理决策。

样本采集方法和地点

使用改良的手持式吹叶机（Husqvarna E-tech X-series 125BV）作为DVAC昆虫吸集装置采集叶蝉。采集到的样本被转移到细网中，并在野外通过冷冻（-20°C或-40°C）进行灭活，随后带回实验室进行显微镜鉴定和病毒检测。环境植物（大麦、小麦和其他草类）的叶片用无菌剪刀剪下，放入无菌塑料袋中

WDV引物组合

根据“材料与方法”部分描述的设计方法（以及附注S3），获得了最佳的WDV-W和WDV-B引物组合（见图1、表2）。600mp/cp-WDV-W和1000cp-WDV-B引物组合包含两个外引物（F3、B3）、两个内引物（FIP、BIP）和一个环引物（LF）。由于引物设计软件的限制，这两种引物组合均未设计反向环引物（LB）。还制备了第三个通用引物组合（2500RepA-WDV）

讨论

系统发育分析表明，小麦矮缩病毒（WDV）分为两个具有不同宿主偏好的谱系，但偶尔也会发生交叉感染（Schalk等人，1989年；Schubert等人，2002年）。准确且快速地检测WDV毒株是谷物生产区有效疾病监测和作物管理的关键。本研究在之前的基础上进一步发展了WDV检测技术，之前的研究虽然能够检测到WDV，但无法区分不同毒株（Trzmiel & Hasiow-Jaroszewska，2020年；?elik &

结论

本文描述的基于谱系的LAMP检测流程结合了合理的引物设计、引物排除分析和无需提取的样本制备方法，能够在最少的基础设施条件下在一小时内准确检测出WDV-W和WDV-B。该检测方法补充了现有的基于PCR的技术，提供了一种适用于田间监测和快速疫情评估的便携式替代方案。将这一流程整合到区域监测计划中，可以加深我们对WDV的认识

CRediT作者贡献声明

雷吉娜·格尔斯滕布兰德（Regina Gerstenbrand）：软件开发、数据分析。埃娃·西塔（éva Szita）：验证工作、实验研究。格莱戈里·托尔特（Gergely Tholt）：监督工作、方法设计、实验研究、概念构思。扬卡·西蒙（Janka Simon）：验证工作、软件开发、项目管理、方法设计、数据管理。科内尔·格罗（Kornél Ger?）：数据分析。费伦茨·萨穆（Ferenc Samu）：撰写文本——审稿与编辑、监督工作、资源协调、项目管理、资金争取、概念构思。博通德·宗博尔·佩尔蒂克斯（Botond Zsombor Pertics）：撰写文本——审稿与编辑、原创内容

数据可用性声明

所有数据均包含在本文的正文和补充材料中。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在任何利益冲突。

资助

本研究得到了匈牙利国家研究、发展与创新办公室（National Research, Development and Innovation Office）的资助，项目编号为[RRF-2.3.1-2022-00006]和[K134811]，以及HUN-REN CAR项目的青年研究员资助计划[PáLY/104-1/2024]的支持。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者感谢István Tóbiás提供Pula分离株（FN806786.1），以及András Kis（匈牙利农业与生命科学大学遗传与生物技术研究所）提供H07分离株（FM210034.1）。同时感谢Gy?rgy Schneider（佩奇大学医学院医学微生物学系）、Domonkos Sváb和István Tóth（HUN-REN兽医医学研究所）提供T22大肠杆菌（E.coli）菌株。