草鱼（Ctenopharyngodon idella）中NF-κB家族、IκB抑制剂、IKK相关基因的全基因组鉴定、进化分析及表达研究，以及这些基因对细菌和病毒感染的响应

《Fish & Shellfish Immunology》：Genome-wide identification, evolutionary and expression analyses of the NF-κB family, the IκB inhibitors, IKK-associated genes in grass carp ( Ctenopharyngodon idella), and their responses to bacterial and viral infections

NF-κB信号通路在鱼类免疫中起关键作用，本研究通过基因组分析鉴定出草 carp（Ctenopharyngodon idella）中包含5个NF-κB转录因子、7个IκB抑制蛋白、3个IKK复合体成员及2个IKK相关激酶，并发现这些基因分布在13条染色体上且与鲤同源。转录组学显示NF-κB2、IκBαa/b等基因在多种组织中高表达并快速响应病原体感染。qRT-PCR验证感染后脾脏和头肾中相关基因表达显著变化，为解析鱼类免疫机制奠定基础。

　　

马琳·吕|关玉晨|文星·李|一忠·卢|博·唐|建国·苏

中国华中农业大学洪山实验室，武汉430070

摘要

核因子κB（NF-κB）信号通路在抵御细菌感染中起着不可或缺的作用。然而，其核心组分——NF-κB转录因子、IκB抑制剂、典型的IKK复合体以及IKK相关激酶的完整组成在大多数硬骨鱼类中仍不清楚。在这项研究中，我们对草鱼（Ctenopharyngodon idella）进行了全基因组分析，系统地鉴定了五个NF-κB家族成员（RelA和NF-κB1作为典型的效应因子；RelB和NF-κB2作为非典型效应因子；以及c-Rel），七个NF-κB抑制剂（IκB）成员（包括经典抑制剂IκBα及其两个亚型IκBαa和IκBαb，还有IκBβ、IκBNS、IκBζ、IκBε和Bcl-3），三个典型的IKK复合体组分（IKKα、IKKβ和IKKγ/NEMO），以及两个IKK相关激酶（TBK1和IKKε）。这些基因分布在13条染色体上。同线性分析显示，这三个基因复合体的染色体排列在鲤科鱼类中高度保守。序列分析和系统发育分析都表明，每个复合体内的成员都高度保守。转录组数据表明，NF-κB、IκB、典型的IKK复合体和IKK相关激酶的成员在各种组织中广泛表达，其中NF-κB2、IκBαa、IκBαb和TBK1在组织中的基础表达水平相对较高，并且能积极响应细菌和病毒的挑战。qRT-PCR分析进一步证实，在草鱼感染草鱼呼肠孤病毒（GCRV-II）或Aeromonas hydrophila后，这些基因在脾脏和头部肾脏中的表达发生了显著变化。总之，这项关于NF-κB、IκB、典型的IKK复合体和IKK相关激酶的全面系统分析为后续研究硬骨鱼类中NF-κB和干扰素相关信号通路的功能奠定了重要的分子基础。

引言

先天免疫是机体抵御病原体入侵的第一道防线[1]。其核心是一组高度保守的模式识别受体（PRRs），能够迅速检测到与微生物相关的分子模式（MAMPs）。这种识别会触发下游信号级联反应，最终导致抗菌肽和细胞因子等效应分子的表达[2]、[3]。其中，核因子κB（NF-κB）信号通路作为中心介质，在调节炎症反应、细胞存活、增殖和分化等关键生物过程中发挥着不可或缺的作用[4]、[5]。这一通路的精确调控对于维持免疫稳态至关重要，其异常激活与多种疾病的发展密切相关，包括慢性炎症、自身免疫性疾病和癌症[6]。鉴于NF-κB在免疫和疾病中的关键作用，了解其在不同物种中的进化保守性和功能动态，特别是在经济上重要的脊椎动物如鲤科鱼类中，具有重要意义。

NF-κB信号通路主要由三个核心基因家族组成：NF-κB转录因子家族、IκB抑制剂蛋白家族和典型的IKK激酶（IKK）复合体[7]。NF-κB转录因子家族包括RelA（p65）、c-Rel、RelB、NF-κB1（p50，由其前体p105加工而来）和NF-κB2（p52，由其前体p100加工而来）[6]。IκB抑制剂蛋白家族包括IκBα、IκBβ、IκBNS、IκBζ（也称为MAIL）、IκBε和Bcl-3[8]。IKK家族包括两个主要亚组：典型的IKK复合体亚单位（IKKα、IKKβ和调节亚单位IKKγ/NEMO）以及IKK相关激酶（TBK1和IKKε），后者不构成典型的IKK复合体，而是主要参与干扰素信号传导[9]。功能上，NF-κB通路传统上分为典型通路和非典型通路，两者都由典型的IKK复合体介导，并且与TBK1/IKKε依赖的抗病毒通路不同。典型通路由细胞膜受体（如Toll样受体（TLRs，除TLR3外）、白细胞介素-1受体（IL-1R）、肿瘤坏死因子受体（TNFR）、B细胞受体（BCR）和T细胞受体（TCR）激活，从而激活TAK1激酶复合体。TAK1随后磷酸化并激活典型的IKK复合体（IKKα/IKKβ/NEMO）[10]。激活的典型IKK复合体会磷酸化抑制性IκBα蛋白，使其发生泛素化并通过蛋白酶体降解。这释放出典型的NF-κB转录因子二聚体，通常由RelA或c-Rel与NF-κB1组成[11]、[12]、[13]。该二聚体转移到细胞核中，诱导参与细胞存活、炎症反应和免疫反应的基因表达[14]。相比之下，非典型通路由TNF受体家族的一部分成员（如分化簇40（CD40）、NF-κB受体激活因子（RANK）、淋巴毒素-β受体（LTβR）和B细胞激活因子受体（BAFFR）触发，依赖于NF-κB诱导激酶（NIK）和IKKα同二聚体（不依赖于NEMO）将p100加工成p52，从而激活RelB/NF-κB2二聚体，调节淋巴器官的发育[15]。同时，一个不同的抗病毒信号模块由IKK相关激酶TBK1和IKKε而不是典型的IKK复合体介导。这些激酶由细胞质核酸传感器（如RIG-I、MDA5和cGAS）、TLR3或TLR4激活，主要磷酸化转录因子IRF3和IRF7，导致它们向细胞核转位并诱导I型干扰素的产生，这对抗病毒防御至关重要[16]、[17]。尽管TBK1和IKKε在某些情况下可以促进NF-κB的激活，但这属于次要功能，而非其主要生理作用[9]。在细菌或病毒感染时，特定的PRRs会识别MAMPs[18]。这种识别会触发下游信号级联反应，最终激活典型的IKK复合体，从而启动上述典型的NF-κB激活通路，引发炎症和抗菌的转录反应[19]、[20]。虽然该通路的各个组分和分支在模式生物中已经得到了很好的研究，但在硬骨鱼类中NF-κB转录因子、IκB抑制剂和典型的IKK复合体（以及相关的TBK1/IKKε模块）的进化轨迹和潜在的共同进化仍很大程度上未被探索，需要进行全面的比较基因组分析。

在哺乳动物中，NF-κB通路及其组分已经得到了广泛而深入的研究。然而，在硬骨鱼类这一重要的脊椎动物群体中，这一通路的完整情况仍不清楚。作为较低等脊椎动物的代表，鱼类具有与高等脊椎动物共享的保守特征，同时也表现出独特的复杂性和多样性，这得益于它们独特的进化历史和水生环境。全基因组复制（WGD）事件和其他基因复制事件在硬骨鱼类中产生了大量的基因拷贝[21]。因此，许多基因家族，特别是那些参与免疫的基因家族，在鱼类中的成员数量显著多于哺乳动物[22]、[23]。目前，在多种鱼类中已经鉴定出两种或更多的IκBα变体，这主要是由于它们进化历史中的WGD[24]、[25]、[26]。此外，在鲑科鱼类（如虹鳟鱼）中，IκB家族的成员数量显著增加[27]。相比之下，NF-κB转录因子家族和典型的IKK复合体的核心成员数量在脊椎动物中高度保守，而IKK相关激酶TBK1和IKKε也因其在干扰素信号传导中的关键作用而表现出强烈的进化保守性[27]。这种差异表明，不同的基因家族可能在对相同进化事件的响应中遵循不同的进化约束和功能分化路径。

尽管在少数鱼类物种中对NF-κB通路基因的特征有了深入研究，但在大多数硬骨鱼类中的了解仍然有限，仅识别出了一些孤立的成员。草鱼（Ctenopharyngodon idella（C. idella）由于缺乏对NF-κB转录因子、IκB抑制剂、典型的IKK复合体组分和IKK相关激酶的全面基因组规模鉴定和综合分析，仍然存在重要的知识空白。本研究利用现有的全基因组序列和综合生物信息学策略，对草鱼中的这些基因家族进行了全基因组鉴定，包括系统发育和蛋白质结构分析、表达谱分析以及它们对病原体挑战的反应研究。我们的工作绘制了草鱼中NF-κB信号网络及其相关干扰素相关激酶模块的完整图谱，从而为阐明其抗病原体免疫反应的分子机制奠定了基础。

章节片段

在草鱼基因组中全基因组范围内鉴定NF-κB、IκB、典型的IKK复合体和IKK相关激酶基因

通过比较基因组学方法，在草鱼基因组（PRJNA745929）中鉴定出编码NF-κB、IκB、典型的IKK复合体组分（IKKα、IKKβ和NEMO）以及IKK相关激酶（TBK1和IKKε）的候选基因（表S1）。使用斑马鱼（Danio rerio（D. rerio）和人类（Homo sapiens（H. sapiens）的蛋白质序列（表S1）作为查询，在TBtools（v2.390）中对草鱼基因组数据库进行TBLASTN搜索，E值截止值为1×10^-5

草鱼基因组编码五个NF-κB基因、七个IκB基因和五个IKK相关基因

对草鱼基因组的全面分析鉴定出了五个NF-κB成员（RelA、c-Rel、RelB、NF-κB1和NF-κB2）、七个IκB成员（IκBαa、IκBαb、IκBβ、IκBNS、IκBζ、IκBε和Bcl-3），以及五个IKK相关基因，包括典型的IKK复合体亚单位（IKKα、IKKβ、IKKγ/NEMO）和IKK相关激酶（TBK1和IKKε）。为了进一步研究它们的内在特性，我们对编码的蛋白质进行了深入的生物信息学分析（表1）。

讨论

作为介导先天免疫和适应性免疫反应的核心信号通路，NF-κB通路在调节炎症、细胞存活和抗病毒防御方面起着关键作用[4]。然而，在硬骨鱼类中，尤其是像草鱼这样的经济重要物种中，其核心组分——NF-κB、IκB和IKK相关基因的系统性鉴定和表征仍然有限。在这项研究中，我们全面鉴定并分析了所有这些组分

结论

本研究系统地鉴定了草鱼（C. idella）中NF-κB信号通路的核心组分——包括五个NF-κB基因、七个IκB基因和五个IKK相关基因——从而阐明了其进化和功能结构。我们的分析表明，虽然NF-κB和IKK家族（包括典型的和IKK相关分支）具有保守的骨架结构，但IκB家族中的IκBα成员在硬骨鱼类中演化出了两种不同的亚型

数据可用性

数据可应要求提供。

CRediT作者贡献声明

所有作者均已阅读并同意已发表的手稿版本。J.S.和M.L.：概念构思；M.L.、W.L.、Y.X.、G.C.、S.W.和Y.L.：方法学；J.S.：项目管理和监督；W.L.和S.W.：验证；M.L.：撰写原始草稿；J.S.：撰写和审稿。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

利益冲突声明

作者声明他们没有可能影响本工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（32373164）的支持。