破坏 Pdcd-1 上游增强子可增强 T 细胞功能及抗肿瘤反应

《Immunology Letters》：Genetic Disruption of Pdcd-1 Upstream Enhancer Boosts T Cell Function and Antitumor Responses

　　

程序性细胞死亡蛋白 1 (Programmed cell death 1, PD-1) 是一种抑制性受体，可驱动肿瘤中 T 细胞的耗竭，限制抗肿瘤免疫。目前的 PD-1 阻断疗法取得的成功有限。为了揭示调节 PD-1 的新策略，研究人员利用 CRISPR-Cas9 敲除小鼠模型研究了 Pdcd-1 基因的一个上游增强子 (UpEnh)。该增强子的缺失降低了多种 T 细胞亚群中的 PD-1 表达。在肿瘤环境中，这种缺失降低了瘤内耗竭的 CD8+、常规 CD4+、调节性 T 细胞 (Treg) 和 γδ T 细胞上的 PD-1 水平。这导致 CD8+和 γδ T 细胞功能改善，并促进了更强的抗肿瘤免疫。研究结果表明，UpEnh 是 PD-1 的关键调节因子，是一个潜在的治疗靶点。

论文解读：靶向 Pdcd-1 上游增强子——重塑 T 细胞抗肿瘤免疫的新策略

本研究由日本名古屋大学医学研究生院免疫学系的 Chandsultana Jerin、Wooseok Seo 和 Hiroyoshi Nishikawa 团队合作完成，发表于《Immunology Letters》。该研究聚焦于程序性细胞死亡蛋白 1 (Programmed cell death 1, PD-1) 在肿瘤免疫中的调控机制。

研究背景与立题依据

PD-1 作为一种关键的抑制性受体，其过度表达会导致 T 细胞耗竭，从而限制机体的抗肿瘤免疫力。尽管现有的抗 PD-1/PD-L1 抗体疗法在临床取得了一定进展，但其疗效有限，且存在耐药性问题。既往研究表明，Pdcd-1 基因上游约 23kb 处存在一个在慢性感染和肿瘤中特异性开放的染色质区域（即上游增强子，UpEnh），该区域在耗竭的 CD8⁺T 细胞中尤为活跃。然而，该增强子在复杂的肿瘤微环境 (Tumor microenvironment, TME) 中对其他 T 细胞亚群（如 γδ T 细胞和调节性 T 细胞）的调控作用尚不明确。因此，研究人员旨在通过构建 UpEnh 基因敲除 (Knockout, KO) 小鼠模型，系统阐明该增强子在全 T 细胞谱系中的调控功能及其对抗肿瘤免疫的影响。

关键技术方法

研究人员利用 CRISPR-Cas9 基因组编辑技术构建了 UpEnh KO 小鼠模型，并通过 PCR 和 Sanger 测序验证基因型。通过流式细胞术 (Flow cytometry) 分析了胸腺、脾脏及肿瘤浸润淋巴细胞 (Tumor-infiltrating lymphocytes, TILs) 中不同 T 细胞亚群的表面标志物及 PD-1 表达水平。采用定量实时荧光定量 PCR (Quantitative Real-Time PCR, qRT-PCR) 检测基因转录水平。在功能层面，研究人员建立了 B16F10-OVA 黑色素瘤小鼠皮下移植瘤模型评估体内抗肿瘤效果，并利用体外 T 细胞活化及耗竭模型、Treg 抑制实验等探究细胞功能变化。

研究结果

3.1 UpEnh 是胸腺细胞 Pdcd-1 表达正常调控所必需的

研究人员首先证实了 UpEnh 缺失并不影响胸腺中双阴性 (Double Negative, DN)、双阳性 (Double Positive, DP) 及单阳性 (Single Positive, SP) T 细胞的发育数量，表明 T 细胞发育基本正常。然而，流式分析显示，UpEnh KO 小鼠的 DN、CD8 SP 和 CD4 SP 胸腺细胞以及 αβ 和 γδ 谱系中的 PD-1 表达均显著降低。这表明 UpEnh 对于胸腺 T 细胞群体中的 PD-1 基因表达至关重要，且这种调控独立于细胞发育过程。

3.2 UpEnh 全局调控外周 T 细胞的 PD-1 表达

在外周脾脏稳态下，UpEnh KO 小鼠的 CD8⁺T 细胞、CD4⁺常规 T 细胞 (Conventional T cells, Tconv) 和 Treg 的绝对数量有所增加，但各亚群的频率未变。重要的是，与野生型 (Wild-Type, WT) 相比，UpEnh KO 小鼠的 Treg 和 γδ T 细胞中 PD-1 的表达频率和强度均降低了近 50%，而 CD8⁺和 CD4⁺Tconv 细胞在未激活状态下几乎不表达 PD-1，故无明显变化。这说明 UpEnh 是维持外周特定 T 细胞亚群基础 PD-1 表达的关键元件。

3.3 UpEnh 是维持激活后 T 细胞 PD-1 表达所必需的

急性体外 TCR 刺激实验显示，UpEnh KO 的 CD8⁺T 细胞在激活 48 小时后 PD-1 上调水平与 WT 相当，但在模拟耗竭的反复抗原刺激模型中，OT-I CD8⁺T 细胞的 PD-1 维持能力受损。更为显著的是，UpEnh KO 的 Treg 和 γδ T 细胞在体外激活后，其 PD-1 的诱导表达受到严重损害，且伴随早期活化标志物 CD69 的轻微下降，提示 UpEnh 在这些细胞亚群的激活依赖性 PD-1 调控中起核心作用。

3.4 UpEnh 缺失显著增强抗肿瘤免疫反应

在 B16F10-OVA 黑色素瘤模型中，UpEnh KO 小鼠的肿瘤生长显著受到抑制。虽然肿瘤内总的免疫细胞浸润数量无差异，但深入表型分析发现，UpEnh KO 小鼠的 CD8⁺TILs、CD4⁺Tconv、Treg 和 γδ TILs 中 PD-1 的表达水平均显著降低。这表明 UpEnh 介导了肿瘤微环境中多种 T 细胞谱系的细胞内在 PD-1 调控。

3.5 UpEnh 缺失改善 CD8⁺T 细胞功能障碍状态与功能

进一步分析显示，UpEnh KO 的 CD8⁺TILs 不仅 PD-1 降低，其他抑制性受体如 TIM-3、TIGIT 和 LAG-3 的表达强度和频率也显著下降。在亚群分布上，UpEnh KO 促进了具有干细胞特性的祖细胞耗竭亚群 (Progenitor exhausted cells, SLAMF6⁺TIM3^?) 的增加，而减少了终末耗竭亚群 (Terminal exhausted cells, SLAMF6^?TIM3⁺)。功能上，终末耗竭细胞产生干扰素-γ (Interferon-γ, IFNγ) 和颗粒酶 B (Granzyme B, GZMB) 的能力增强，祖细胞亚群则表现出更高的肿瘤坏死因子-α (Tumor Necrosis Factor-α, TNFα) 分泌能力。此外，UpEnh KO 的 γδ T 细胞也表现出 TNFα 和 IL-17A 水平的升高。体外抑制实验证实，UpEnh KO 的 Treg 细胞仍保持正常的抑制功能，排除了因 Treg 功能丧失导致的抗肿瘤效应。

结论与讨论

本研究揭示了 UpEnh 作为一个全局性的顺式调控元件，在生理和病理条件下跨多种 T 细胞状态调控 PD-1 基因表达的关键作用。遗传删除该增强子可显著减弱 CD8⁺T 细胞耗竭，恢复其效应功能，并促进 γδ T 细胞的细胞因子产生，最终协同增强抗肿瘤免疫。与全身性 PD-1 敲除不同，UpEnh 缺失并未破坏胸腺选择或引发明显的自身免疫病理，也未损害 Treg 的抑制功能，表明这是一种更具特异性和安全性的干预策略。综上所述，靶向 Pdcd-1 上游增强子提供了一种精确调控 T 细胞 PD-1 表达的新型治疗范式，有望克服现有免疫检查点阻断疗法的局限性，推动下一代免疫治疗的发展。