通过壳聚糖水凝胶固定化技术，显著提高了细菌植酸酶的热稳定性和催化性能

《International Journal of Biological Macromolecules》：Improved thermostability and catalytic performance of bacterial phytase via chitosan hydrogel immobilization

本研究从伊朗卡扎米大学细胞与分子生物学系分离鉴定产植酸酶的Bacillus pumilus（PersiPhytase1），通过壳聚糖水凝胶固定化显著提升其热稳定性（80°C保持85%活性）、广pH活性（pH5-9）及催化效率（Km降低，Vmax提高），循环使用后活性保留39.52%，为农业应用提供新策略。

　　

Aisouda Mohammadzadeh Naneh Karan | Elaheh Motamedi | Marzieh Ghollasi | Hossein Ghanavati | Mehrshad Zeinalabedini | Shohreh Ariaeenejad

伊朗德黑兰Kharazmi大学生物科学学院细胞与分子生物学系

摘要

植酸酶对于提高磷的生物利用率和减轻植酸在农业中的负面影响至关重要。本研究从根际土壤和禽类废弃物中分离出一种产植酸酶的细菌，并通过16S rRNA测序鉴定其为Bacillus pumilus（PersiPhytase1）。纯化的植酸酶属于碱性植酸酶，分子量约为39 kDa，具有较高的热稳定性和蛋白酶稳定性。对这种酶进行了生化表征，并将其固定在壳聚糖基水凝胶中以增强其稳定性。固定后的植酸酶在pH 5.0–9.0范围内均具有活性，其中pH 7.0时活性最高，且在pH 9.0时仍保持超过90%的活性。温度曲线分析显示其在50°C时活性最佳，在80°C时仍能保持85%以上的活性。动力学参数表明：固定后K_m从11.41 mM降低到5.14 mM，V_max从0.054 mM·min^?1增加到0.063 mM·min^?1；催化转化率（k_cat）和催化效率（k_cat/K_m）分别从0.108 min^?1增加到0.127 min^?1和0.00954 mM^?1·min^?1。经过10次重复使用后，固定酶的活性仍保留了39.52%，且释放量极少（即使在80°C时也只有24.67%）。热力学研究表明，壳聚糖基水凝胶固定显著提高了植酸酶的半衰期和构象稳定性，其在70°C时的ΔG为91.9 kJ/mol，ΔS为?0.157 kJ/mol·K。这些结果表明，在实验室条件下，壳聚糖基水凝胶固定技术能够提升植酸酶的稳定性和催化性能，为其在饲料领域的应用提供了潜力，但还需在加工和实际使用条件下进一步验证。

缩写说明

PSM
植酸酶筛选培养基
SMF
沉浸发酵
CFS
无细胞上清液
CRC 含有...的显色试剂
CH 壳聚糖
AAm 丙烯酰胺
MBA N,N-亚甲基双丙烯酰胺
SDS 十二烷基硫酸钠
TEMED 四甲基乙二胺
APS 过硫酸铵
DTT 苏木酚蓝-二硫苏糖醇
GMA 甲基丙烯酸缩水甘油酯
LB Luria–Bertani培养基
SET 氯化钠、乙二胺四乙酸、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐
EDTA 乙二胺四乙酸
rRNA 核糖体核糖核酸
PCR 聚合酶链反应

化学试剂

本研究使用了以下化学试剂：α-胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、2,2-二苯基-1-吡啶基肼(DPPH)、葡萄糖、硝酸铵(NH?NO?)、氯化钙(CaCl?)、七水合硫酸镁(MgSO?·7H?O)、四水合硫酸锰(MnSO?·4H?O)、氯化钾(KCl)、七水合硫酸铁(FeSO?·7H?O)、琼脂、磷酸氢钠(Na?HPO?)、氯化钠(NaCl)、磷酸二氢钾(KH?PO?)、硫酸(H?SO?)和柠檬酸。

16S rRNA基因的PCR扩增

使用通用细菌引物成功扩增了所选细菌分离株（包括PersiPhytase1）的16S rRNA基因。PCR反应产生了约1500 bp的特异性扩增产物，证实了目标基因区域从基因组DNA中成功扩增。

通过16S rRNA测序进行分子鉴定

使用Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)将PersiPhytase1的16S rRNA基因序列与GenBank数据库进行比对分析。

结论

总体而言，本研究展示了通过壳聚糖-水凝胶固定技术实现的一系列性能提升：固定后的植酸酶具有更低的K_m值和更高的V_max值，更好的热/热力学稳定性，对胃肠道蛋白酶的抵抗力更强，并且在多次重复使用中表现出更好的操作稳定性。这些结果总结了该固定策略的主要功能优势。

作者贡献声明

-Aisouda Mohammadzadeh Naneh Karan：负责撰写初稿和实验研究 -Elaheh Motamedi：负责撰写、审稿和编辑工作，以及方法验证 -Marzieh Ghollasi：负责实验监督和方法设计 -Hossein Ghanavati：负责软件应用、方法优化和数据管理 -Mehrshad Zeinalabedini：负责撰写、审稿和编辑工作，以及方法优化和数据管理 -Shohreh Ariaeenejad：负责撰写、审稿和编辑工作，资源协调、项目管理和概念构思

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了伊朗农业生物技术研究所(ABRII)的资助。