一种嵌合型利钠肽（Ev-NP）通过增强环磷酸鸟苷（cGMP）及其下游信号通路靶点，抑制异丙肾上腺素（ISO）在体内和体外模型中诱导的心肌肥大。该研究利用计算机模拟技术（in silico）对Ev-NP与NPR-A和NPR-B受体的对接及结合效率进行了分析

《Peptides》：A chimeric natriuretic peptide (Ev-NP) inhibits isoproterenol (ISO)-induced hypertrophic growth in in vivo and in vitro models by enhancing cGMP and its downstream signaling targets: in silico docking and binding efficacy analysis with NPR-A and NPR-B receptors

抗肥厚双受体激活肽Ev-NP的体外与体内研究及其机制探索。通过H9c2细胞模型和Wistar大鼠实验，证实Ev-NP（37aa）显著抑制ISO诱导的肥厚生长（P<0.001），其机制包括增强cGMP水平（体外）、降低α-sk/β-MHC表达及调节炎症因子（细胞实验）；体内实验显示Ev-NP减少90%心脏肥厚并恢复NPR-A/cGMP水平。分子模拟显示Ev-NP对NPR-A亲和力（-490.17 kcal/mol）显著高于NPR-B（-390.77 kcal/mol），且优于天然ANP（-314.68 kcal/mol）。分隔符：

　　

Jayashree Bheeman | Ananthan Krishnan Dhanabalan | Gopinath Nagaraj | Tharshini Elangovan | Dhatchana Moorthy Nachiappan | Suresh Dhanusu | Elangovan Vellaichamy

印度泰米尔纳德邦金迪校区马德拉斯大学生物化学系肽研究与分子心脏病学单元

摘要

我们设计并合成了一种嵌合型利钠肽（Ev-NP），旨在实现NPR-A/NPR-B双重激活、抗降解性，并具有显著的肾脏保护作用和抗心肌肥大效果。在本研究中，我们旨在探讨新型嵌合型利钠肽Ev-NP（37个氨基酸）对H9c2细胞中异丙肾素（ISO）诱导的心肌肥大的抑制作用，分别在体外（in vitro）和大鼠模型（in vivo）中进行验证。我们评估了Ev-NP在10至50 nM浓度范围内，对暴露于ISO的H9c2细胞的抗心肌肥大作用及cGMP信号通路的影响，实验持续时间为24小时。与对照组相比，Ev-NP处理组细胞的cGMP水平显著升高（P < 0.001）。此外，Ev-NP通过提高cGMP水平显著抑制了ISO诱导的心肌肥大（P < 0.001）。在过表达Npr1的H9c2细胞中联合使用Ev-NP时，抗心肌肥大效果更为显著，表现为心肌肥大相关基因（α-sk、BNP、β-MHC）的表达显著降低（P < 0.001）。细胞因子阵列分析显示，Ev-NP还能纠正ISO引起的促炎因子和生长因子的异常表达。体内实验表明，Ev-NP能显著降低Wistar大鼠的心肌肥大程度（达90%），并恢复ISO导致的cGMP和NPR-A水平下降。计算机模拟（in silico）分析显示，Ev-NP对NPR-A受体的亲和力更强（结合能为–490.17 kcal/mol），而NPR-B的结合能为–390.77 kcal/mol；天然ANP与NPR-A的结合能为–314.68 kcal/mol。这些结果表明Ev-NP具有优异的抗心肌肥大潜力，有望用于治疗人类的心肌肥大和心力衰竭。

引言

心房利钠肽（ANP）、脑利钠肽（BNP）、C型利钠肽（CNP）和Dendroaspis利钠肽（DNP）均属于利钠肽（NP）家族，它们具有保守的环状结构，尽管各自由不同的基因编码[1]、[2]、[3]。这些肽通过与特异性细胞表面受体结合，发挥利尿、利钠、血管舒张、抗增殖、抗炎和抗心肌肥大等生理作用[4]、[5]、[6]、[7]。利钠肽通过与受体结合激活细胞内的鸟苷酸环化酶（guanylate cyclase），促使GTP转化为cGMP，进而激活cGMP依赖性蛋白激酶（protein kinase G, PKG），这是NP信号传导的主要下游效应分子[8]。激活的PKG调控多种生物学过程，如蛋白质磷酸化、离子通道调节和基因表达[9]。尽管利钠肽具有强大的心脏保护和肾脏保护作用，但由于其半衰期极短且容易被neprilysin等肽酶降解[10]，其临床应用受到限制。此外，NPR-C介导的清除机制进一步减少了循环肽的浓度，缩短了其作用时间[11]。长期暴露于利钠肽还可能导致NPR-A受体脱敏，从而降低cGMP信号传导效率[12]。 为克服这些局限性，研究人员通过组合多种利钠肽的结构成分，开发出具有更强受体结合能力、更高代谢稳定性、更低清除率和更持久NPR-A激活效果的嵌合型利钠肽[13]、[14]。VNP是一种嵌合肽，由CNP的22个氨基酸序列与ANP的C端5个氨基酸片段融合而成，表现出增强的利钠、血管舒张和抗增殖作用[15]。CD-NP通过将CNP与DNP的C端连接，同时激活pGC-A和pGC-B受体，同时降低低血压风险[16]。动物和人体研究表明，CD-NP的临床效果优于Nesiritide：在犬类实验中，静脉注射CD-NP可显著增加利尿作用，且低血压反应较轻[17]。一项人体I期临床试验证实，CD-NP具有利钠和抑制醛固酮的作用，且不会引起严重低血压[18]。本研究表明，DNP的羧基末端增强了CNP与GC-A受体的结合，从而在犬类和人类实验中发挥肾脏保护作用。MANP是一种耐蛋白酶的ANP类似物，在体内实验中表现出更强的利尿和抗高血压效果[19]。 嵌合肽Ev-NP通过整合天然利钠肽和先前嵌合肽的关键特性进行合理设计：保留了CNP环状结构以增强与NPR-A受体的结合能力，并通过NPR-B发挥血管舒张和抗纤维化作用，同时降低低血压风险（相比ANP/BNP）[17]。添加ANP的N端序列增强了利钠、利尿和血管舒张效果，并扩大了NPR-A的激活范围[18]、[19]。DNP的C端片段增加了15个氨基酸，增强了利尿作用、NPR-A激活效果，并提高了对neprilysin降解的抵抗力[17]、[20]、[21]。Ev-NP旨在成为一种兼具双重NPR-A/NPR-B激活作用、强效肾脏保护作用、低低血压风险、抗neprilysin降解能力的37个氨基酸肽。本研究证实Ev-NP在体外和体内模型中均具有抗心肌肥大效果。此外，计算机模拟分析揭示了Ev-NP与NPR-A和NPR-B的相互作用机制。

化学试剂

Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、胰蛋白酶-EDTA、胎牛血清（FBS）和抗生素溶液购自印度孟买的HIMEDIA公司；异丙肾素盐酸盐（ISO，产品编号#51309）由美国圣路易斯的Sigma Chemicals公司提供；TRIZOL试剂（产品编号#612106481001730）和PCR扩增试剂盒（产品编号#61060213000）由印度班加罗尔的Merck公司提供；cDNA转化试剂盒（产品编号#K1622）及FAM-MGB探针购自美国Thermo Scientific公司；propidium iodide（PI）也来自同家公司。

嵌合型利钠肽（Ev-NP）的设计与合成

图1展示了嵌合肽Ev-NP的结构。Ev-NP（37个氨基酸）采用模块化设计策略合成，保留了CNP的环状结构，并结合了其他利钠肽的末端序列，形成具有双重功能的活性肽。选择17个氨基酸的CNP环作为结构核心，因其对NPR-B受体具有高亲和力，同时具有血管舒张和抗纤维化作用，且低血压反应相对较轻。

讨论

本研究首次报道了嵌合肽Ev-NP的设计与合成过程。Ev-NP基于ANP、CNP和DNP的氨基酸序列设计，保留了CNP的环状结构，并将其与ANP的N端（6个氨基酸）和DNP的C端（15个氨基酸）序列融合，形成Ev-NP（见图1A）。CNP环状结构是该肽的核心组成部分。

资助

Dr. EV衷心感谢Rashtriya Uchchatar Shiksha Abhiyan (RUSA) 2.0计划和Tamil Nadu首席部长研究基金（CMRG）对NJB的研究资助。

作者贡献声明

Jayashree Bheeman：负责初稿撰写、数据可视化、验证、方法学设计、数据分析及数据管理。 Ananthan Krishnan Dhanabalan：负责软件开发、数据管理。 Gopinath Nagaraj：参与初稿撰写、数据可视化、验证、方法学设计、数据分析及数据管理。 Tharshini Elangovan：参与初稿撰写、数据可视化、验证、方法学设计及数据管理。 Vellaichamy Elangovan：负责审稿、编辑工作及项目协调。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本研究结果的财务利益冲突或个人关系。

致谢

Dr. E.V.感谢Dr. Gunasekaran Krishnasamy在计算机模拟方面的支持，同时感谢RUSA 2.0计划和CMRG基金对这项研究的资助，以及获得的印度国家专利（专利号561377）。