利用噬菌体展示技术改造的肽修饰石墨烯场效应晶体管（PEM-GFET）检测 skatole（一种有机化合物）

《Talanta》：Detection of skatole using a phage display-derived peptide-modified graphene FET

本研究利用噬菌体展示技术筛选出结合3-甲基吲哚（Skatole）的高效多肽，并将其修饰于石墨烯场效应晶体管（GFET）表面，构建了一种高灵敏度（pM级）且特异性的Skatole检测传感器。该传感器不仅成功检测了猪肉及多种肉类产品中的Skatole，还能通过主成分分析（PCA）区分不同肉类类型，为肉类品质监控提供了便携、低成本的解决方案。

　　

Kakeru Saruwatari|Tharatorn Rungreungthanapol|Shogo Saito|Masayoshi Tanaka|Yuhei Hayamizu|Mina Okochi

东京理化学研究所材料与化学技术学院化学科学与工程系，日本东京目黑区O-okayama 2-12-1，邮编152-8550

摘要

本研究将噬菌体展示技术获得的肽修饰为石墨烯场效应晶体管（GFET），用于检测与猪肉“公猪异味”相关的挥发性有机化合物——斯科托尔（skatole），以实现肉类质量监测。通过噬菌体展示技术筛选出特异性识别斯科托尔的肽，并利用肽阵列和气相色谱-质谱（GC/MS）技术对其进行了评估。随后将这些肽与石墨烯结合序列连接，通过自组装实现一步传感器表面修饰。所制备的传感器表现出极高的灵敏度，检测限可达到皮摩尔级别，并对斯科托尔具有高度选择性。该传感器在检测猪肉及其他肉类产品中的斯科托尔含量方面展现了多功能性，同时还能通过主成分分析（PCA）有效区分不同类型的肉类。

引言

在化学分析、疾病诊断、环境监测和产品质量控制等多种研究和工业应用中，痕量气体检测的需求日益重要。[1]、[2]、[3]、[4] 例如，斯科托尔（化学名为3-甲基吲哚）是一种具有明显粪便气味的挥发性有机化合物（VOC）[5]，主要由哺乳动物消化系统中肠道细菌代谢必需氨基酸L-色氨酸产生[6]。斯科托尔尤其与“公猪异味”相关，这种难闻的气味常见于未阉割公猪的肉和脂肪中，因此它是肉类生产中质量控制的关键目标[7]、[8]。目前，肉类生产中的斯科托尔检测主要依赖训练有素的专业人员的感官评估和比色法[9]。然而，基于人类的检测方法存在不一致性和缺乏标准化的问题，且比色法需要较高的成本，给高效检测带来了挑战[9]。

尽管气相色谱-质谱（GC/MS）等传统分析技术被广泛用于气体检测，但它们通常存在体积庞大、成本高昂以及需要专业操作人员等缺点[10]。为应对这些挑战，石英晶体微天平、表面等离子体共振和场效应晶体管（FET）等新型传感技术受到了关注[11]、[12]、[13]。尤其是石墨烯场效应晶体管（GFET）对气体具有极高的灵敏度[14]、[15]。凭借其高表面积与体积比、零带隙以及优异的气体反应性，GFET能够在无需标记的情况下通过电学性质变化实现气体检测，同时具备低成本、紧凑设计和快速响应的特点[16]、[17]。然而，由于GFET对气体反应性过强，往往缺乏特异性，需要特定的识别探针[18]、[19]、[20]。

许多VOC传感器利用抗体、嗅觉受体和肽等生物分子探针进行目标识别，因为它们对目标物质具有天然亲和力[21]、[22]。其中，肽或短链氨基酸因其对多种目标的独特亲和性而成为气体传感应用中的理想选择[23]。肽的优势在于体积小、成本低、易于处理、修饰和合成[24]、[25]、[26]。与抗体和受体蛋白等其他识别分子相比，肽的尺寸更小，能够在GFET的德拜长度范围内实现高灵敏度检测[27]。这些特性使得肽成为开发高效、特异性气体传感器的理想候选者。然而，由于肽设计方面的挑战，相关研究报道仍然有限[26]。为了识别特定目标所需的肽序列，噬菌体展示肽筛选技术是一种有效的筛选方法，能够高效筛选出高亲和力和选择性的肽[25]、[28]、[29]。该方法通过将编码目标肽的基因插入噬菌体基因组，使外表面展示这些肽。这种方法可以同时筛选数百万至数十亿种肽，从而筛选出高亲和力的目标结合肽，并通过生物淘选进一步富集[30]、[31]。

在本研究中，我们开发了一种基于噬菌体展示技术的肽修饰GFET传感器，能够以皮摩尔级别检测斯科托尔，为传统的GC/MS分析提供了一种无标记、低成本且便携的替代方案。该传感器不仅成功检测了猪肉及其他肉类样品中的斯科托尔，还展示了区分不同肉类类型的能力。这种方法为多种应用中的气味分子检测提供了一个简单、快速且多功能的平台。

实验细节

使用肽阵列和GC/MS评估噬菌体展示肽的斯科托尔结合能力

关于使用含有色氨酸和半胱氨酸二肽的玻璃表面进行斯科托尔结合肽筛选的方法详见补充材料。从噬菌体展示中筛选出的肽通过MultiPep（CEM Japan，东京）技术在纤维素膜上制备成肽阵列，具体过程也记录在补充材料中。肽阵列结合测定和GC/MS分析采用与之前相同的方法进行。

通过噬菌体展示技术筛选斯科托尔结合肽并利用肽阵列和GC/MS进行评估

利用噬菌体展示文库筛选斯科托尔识别肽。由于缺乏合适的官能团，难以直接物理吸附斯科托尔，因此采用了色氨酸（作为斯科托尔的类似物）和半胱氨酸（具有巯基用于表面固定）组成的二肽进行底物修饰。通过Ph.D.-7噬菌体展示肽文库经过两轮生物淘选后获得了21种肽（见表S1）。

结论

本研究旨在利用噬菌体展示技术获得的肽和GFET开发一种灵敏且选择性的斯科托尔检测方法。成功筛选出斯科托尔结合肽，并对其进行了表征和GFET修饰。初步通过噬菌体展示技术筛选出21种肽，其中多数含有CLA序列，表明这些肽对斯科托尔具有较高亲和力。

作者贡献声明

Mina Okochi：撰写、审稿与编辑、项目监督、资金筹集、概念构思。Kakeru Saruwatari：撰写初稿、方法设计、实验研究。Yuhei Hayamizu：项目监督、方法设计、资金筹集。Masayoshi Tanaka：撰写、审稿与编辑、数据管理。Shogo Saito：撰写、审稿与编辑、数据可视化、方法设计。Tharatorn Rungreungthanapol：撰写初稿、方法设计、实验研究

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了“智能处理网络与物理系统基础设施”（SIP）战略创新促进计划（资助机构：NEDO）的支持。感谢东芝公司企业研发中心的Tomizawa Hideyuki先生、Sugizaki Yoshiaki先生和Isobayashi Atsunobu先生对项目的贡献以及GFET材料的提供。此外，本研究还部分获得了的科研资助。