《SCIENCE ADVANCES》：A synergistic interaction between PRMT5 and LSD1 inhibitors in AML
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为解决完全抑制PRMT5存在毒性、需寻找有效协同疗法的问题，研究人员在AML中筛选PRMT5调控通路关键节点的抑制剂，发现了PRMT5与LSD1抑制之间存在合成致死性。两者协同促进AML细胞分化、生长抑制和凋亡，并依此设计出可同时抑制两种酶的新型双靶点化合物，为AML治疗提供了新策略。
在对抗血癌的漫长战役中，科学家们不断寻找着能够精准打击癌细胞、同时避免伤及正常细胞的“智能武器”。急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia, AML）作为一种凶险的造血系统恶性肿瘤，其特征是髓系原始细胞（blasts）的异常增殖和分化阻滞。尽管现有疗法不断进步，但AML患者的预后仍不理想，亟需开发新的治疗策略。近年来，靶向表观遗传调控因子已成为癌症治疗的热门领域。其中，蛋白质精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）和赖氨酸特异性去甲基化酶1（LSD1）是两个备受关注的靶点。PRMT5能催化精氨酸的对称性二甲基化（symmetric dimethylation of arginine, SDMA），对维持癌症干细胞稳态至关重要；LSD1则负责去除组蛋白（如H3K4me1/2和H3K9me1/2）和非组蛋白上赖氨酸的单、二甲基化修饰，影响AML原始细胞的分化。两者均在AML的发生发展中扮演着癌基因的角色。然而，完全抑制PRMT5会带来毒性，而单独靶向其中任何一个靶点的疗效可能有限。那么，能否找到一种方法，既能有效杀伤AML细胞，又能降低毒性风险呢？研究人员将目光投向了“合成致死”策略——即同时抑制两个非致死性靶点，从而选择性地杀死癌细胞。
为此，研究团队开展了一项研究，旨在探索PRMT5与其他靶点抑制剂之间的协同作用，并开发新型双靶点药物。他们发现，PRMT5抑制剂与LSD1抑制剂在多种AML模型中展现出强大的协同效应，能共同重塑细胞转录组，以p53依赖的方式促进AML细胞分化并最终导致生长抑制和细胞凋亡。更引人注目的是，他们成功设计并合成了世界上首类能同时抑制LSD1和PRMT5的双靶点杂交抑制剂，在临床前模型中成功复现了联合用药的效果。这项突破性研究为AML的精准治疗开辟了新道路，相关成果发表在顶级期刊《SCIENCE ADVANCES》上。
为开展此项研究，研究人员运用了多项关键技术方法。在细胞水平，他们使用了靶向小分子筛选、细胞活力检测（MTS和CellTiter-Glo法）、细胞凋亡检测（Caspase-Glo 3/7法）、蛋白质印迹（Western blot）和流式细胞术来分析细胞分化标志物。在分子机制层面，他们通过RNA测序（RNA-seq）进行转录组分析和可变剪接分析（使用rMATS软件），并利用基因集富集分析（GSEA）探寻受影响的通路。在化合物开发与验证方面，他们进行了基于结构的药物设计、酶活性抑制试验、热位移测定、紫外/可见光谱分析以及分子对接模拟。此外，研究人员还通过X射线晶体学解析了抑制剂与LSD1的复合物结构，并在小鼠皮下移植瘤模型（使用MV4-11细胞系）中进行了体内药效评价。
研究结果
A chemical screen identifies synthetic lethal interactions with PRMT5
（化学筛选鉴定出与PRMT5的合成致死相互作用）
为了寻找与PRMT5具有合成致死效应的靶点，研究团队建立了一个靶向小分子筛选系统。他们使用了PRMT5野生型（Prmt5+/+）和杂合缺失型（Prmt5+/?）的MLL-AF9驱动的小鼠AML细胞。基于“PRMT5活性阈值模型”（癌细胞需要>50%的PRMT5活性，而正常细胞在活性残留15-20%时仍可运行），他们假设能进一步降低PRMT5活性或干扰其相关通路的药物会选择性地杀死Prmt5+/?细胞。经过7天药物处理和细胞活力检测，筛选出多个能优先杀死Prmt5+/?细胞的候选药物，其中包括已知的协同药物、化疗药以及新的候选者，如靶向染色质修饰剂LSD1和拓扑异构酶1，或靶向CK2、CDK4/6、ERK1/2等激酶的抑制剂。这项初步筛选为以PRMT5抑制为基础的AML联合疗法找到了有希望的候选搭档。
PRMT5 and LSD1 inhibition synergize to reduce tumor growth in vitro and in vivo
（PRMT5和LSD1抑制在体外和体内协同减少肿瘤生长）
为验证上述候选靶点，研究人员进行了二次筛选，将初筛药物与PRMT5抑制剂PRT220联用。在三种人AML细胞系（MV4-11、K562、U937）中，使用五种不同的协同模型（Chou-Talalay CI、Bliss、HSA、Loewe、ZIP）评估药物相互作用。所有模型一致鉴定出PRT220与GSK-LSD1（一种LSD1抑制剂）之间存在协同相互作用。蛋白质印迹分析证实了药物对靶点的有效结合：PRMT5抑制剂降低了SDMA水平，LSD1抑制剂增加了H3K4me1和H3K4me2水平。在小鼠MV4-11细胞移植瘤模型中，PRMT5抑制剂与LSD1抑制剂的联合治疗使肿瘤体积减少了68%，效果显著优于单药治疗（分别减少31%和45%），且未观察到明显的体重下降，表明治疗耐受性良好。
PRMT5 and LSD1 inhibition converge to transcriptionally regulate pathways linked to cell differentiation
（PRMT5和LSD1抑制共同调控与细胞分化相关的转录通路）
为阐明协同作用的机制，研究人员对经DMSO、PRMT5抑制剂、LSD1抑制剂或两药联合处理的MV4-11细胞进行了RNA-seq分析。结果显示，两种药物对转录组的扰动存在正相关（R=0.29），并共同调控了61个上调和23个下调的基因，这可能是协同效应的基础。虽然联合处理的转录组变化与单药处理（尤其是LSD1抑制剂）高度相关，但联合处理导致了更多基因的失调。基因集富集分析表明，LSD1抑制剂处理上调了与抗原加工和提呈（如HLA-DR、CCL2、CXCR3）相关的基因，这些基因与髓系分化有关。PRMT5抑制剂，尤其是两药联合，导致了类似基因集的上调。流式细胞术分析证实，与单药相比，联合处理显著增加了细胞分化标志物CD11b、CD86、CD45RA、CD68、CD80、HLA-DR、CD163和CD206的表达。同时，联合处理下调了与细胞分裂（如有丝分裂姐妹染色单体分离）相关的基因，表明细胞复制减少。综上，RNA-seq和流式结果均表明，抑制PRMT5和LSD1能协同减少AML细胞增殖并促进其分化。
PRMT5 and LSD1 inhibition synergize to induce apoptosis in a p53-dependent manner
（PRMT5和LSD1抑制以p53依赖的方式协同诱导细胞凋亡）
PRMT5抑制已知会降低剪接保真度，导致包括MDM4、ATR、TIP60在内的参与增殖和DNA损伤应答（DDR）的重要基因发生剪接改变。剪接分析（rMATS）显示，PRMT5抑制导致已知的内含子保留增加和外显子跳跃事件失调，而LSD1抑制的影响较弱。然而，单药或联合处理都导致了细胞周期和应激反应相关基因中重叠的剪接事件失调。近期研究表明，表达p53的AML细胞对LSD1抑制更敏感，且LSD1抑制剂能稳定p53并增强其转录活性。鉴于PRMT5抑制也能激活p53通路，研究人员推测两者的协同效应可能与p53激活有关。他们的假设是：PRMT5抑制通过诱导MDM4外显子6跳跃，降低MDM4蛋白（p53功能的负调控因子）水平，从而增加TP53活性，使细胞对LSD1抑制敏感。实验证实，PRMT5抑制剂处理确实诱导了MDM4外显子6跳跃，导致3天后MDM4蛋白减少。联合处理相比PRMT5抑制剂单药进一步增强了剪接改变，并对应着p53水平的进一步升高。基因集富集分析证实，PRMT5和LSD1的单药及联合抑制都汇聚于激活TP53调控的DDR通路。为了直接证明p53的作用，研究人员构建了TP53基因敲除（P53KO）的MV4-11细胞系。实验发现，在P53KO细胞中，PRMT5与LSD1抑制剂联合处理的协同杀伤效应和诱导凋亡的能力均显著减弱。这些数据为野生型p53的存在与PRMT5和LSD1同时抑制的效应之间提供了直接的机制联系。
Development of first-in-class dual-targeting LSD1/PRMT5 inhibitors
（开发首创新型双靶点LSD1/PRMT5抑制剂）
观察到的显著协同效应激励了研究人员开发能同时靶向两个酶的首创新型双靶点杂交抑制剂。这类双抑制剂相较于单靶点抑制剂，有望提供更强的功效和靶点结合，且使用单一化合物而非两种药物组合，能简化临床转化。基于在反式环丙胺（TCP）类LSD1抑制剂设计和合成方面的丰富经验，团队开始了新型双靶点LSD1/PRMT5抑制剂的设计与合成。这些新分子通过整合LSD1抑制剂和已知结构的PRMT5抑制剂GSK591的结构元件而设计。
Biochemical evaluation toward LSD1 and PRMT enzymes
（针对LSD1和PRMT酶的生化评价）
所有合成的最终化合物都经过酶学测试，以评估其对LSD1和PRMT5的抑制活性，并对PRMT1和PRMT7进行测试以评估其对PRMT5的选择性。所有新型杂交化合物对LSD1的抑制活性均强于TCP。在针对PRMT5的抑制活性方面，所有化合物均在纳摩尔范围内显示出强效抑制，并对PRMT1和PRMT7同工酶具有良好的选择性。其中，化合物1a（MC4455）和4（MC4491）表现最佳，IC50值分别为14 nM和43 nM，被选作进一步生物学分析。生化数据表明，设计LSD1/PRMT5双靶点杂交抑制剂的策略是成功的。50 values for dual LSD1/PRMT5 hybrid inhibitors and reference compounds.">
Structural analysis of MC4455 binding to LSD1 and PRMT5
（MC4455与LSD1和PRMT5结合的结构分析）
研究人员解析了LSD1/CoREST-MC4455复合物的晶体结构。结构表明，该抑制剂具有基于TCP支架的反式LSD1化合物的经典结合模式，包括与FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）辅因子的N5原子形成共价键。伸长的MC4455分子向LSD1催化裂隙边缘延伸，与多个残基相互作用，从而稳定在一个明确的构象。分子对接实验模拟了MC4455与PRMT5的结合模式，预测其结合在与GSK591相同的口袋中，GSK591部分与参考构象高度对齐，而TCP部分则保持溶剂暴露。靶点结合实验证实，MC4455在细胞中能类似GSK591降低SDMA水平，并类似GSK-LSD1增加H3K4me2水平。
The dual LSD1/PRMT5 inhibitor recapitulates the effect of drug combination
（双靶点LSD1/PRMT5抑制剂复现了药物组合的效果）
最后，研究人员评估了化合物MC4455和MC4491是否能复现PRMT5和LSD1抑制剂处理对转录和剪接的影响。用50 nM MC4455和MC4491处理MV4-11细胞3天后进行RNA测序。结果显示，双靶点抑制剂引起的转录组变化、失调通路以及剪接改变，与两药联合处理高度相关。分析表明，PRMT5抑制主要影响剪接，而LSD1抑制主要导致转录本丰度变化，但两者汇聚于调控相似的通路，这解释了它们的协同相互作用。进一步的生物学测试（以MC4455为例）显示，在诱导细胞分化方面，MC4455能增加CD11b阳性细胞的比例，效果与联合处理相当甚至更强。这些结果说明，双靶点抑制剂MC4455成功复现了PRMT5抑制剂与LSD1抑制剂联合使用的效果。
研究结论与讨论
本研究揭示了PRMT5与LSD1抑制剂在AML治疗中意想不到的协同致死效应。这两种表观遗传酶抑制剂通过重塑转录组、协同促进AML细胞分化、生长抑制和凋亡而发挥协同作用，该过程依赖于p53通路。机制上，PRMT5抑制通过诱导MDM4外显子6跳跃来降低MDM4蛋白并激活p53，而LSD1抑制则通过直接作用或应激信号促进p53积累和转录活性，两者共同放大了p53介导的肿瘤抑制效应。
基于这一重要的合成致死相互作用，本研究成功设计、合成并表征了一系列首创的LSD1/PRMT5双靶点杂交抑制剂。其中先导化合物MC4455在生化水平对两个靶点均表现出纳摩尔级的强效抑制活性，并具有良好的选择性。晶体结构解析阐明了其与LSD1的结合模式，为基于结构的理性药物设计提供了基础。在细胞和分子水平，MC4455成功复现了PRMT5i与LSD1i联合使用的转录组、剪接组变化以及促分化效应。
这项研究的发现具有多重重要意义。首先，它揭示了PRMT5与LSD1这两个关键表观遗传调控因子在AML中的新型交叉对话和协同靶向可能性，为理解AML的病理机制提供了新视角。其次，研究证实了同时抑制这两个靶点是一种有效的治疗策略，能够克服单药治疗的局限性并潜在降低PRMT5完全抑制带来的毒性。最重要的是，研究团队开创性地开发了首类LSD1/PRMT5双靶点抑制剂，验证了“一石二鸟”策略在AML治疗中的可行性。双靶点抑制剂相比传统药物组合，具有简化治疗方案、确保协同剂量比例、避免药物间相互作用、提高患者依从性等潜在优势，临床转化前景广阔。尽管在先导化合物的溶解度和体内药效等方面仍需进一步优化，但此项工作无疑为开发下一代AML表观遗传靶向疗法奠定了坚实的基础，并可能拓展至其他依赖这些通路的癌症类型。
