《Microorganisms》：Effects of spoIIE and rsfA Knockout on Spore Formation, Cell Growth, 2,3-Butanediol Synthesis and Heterologous Protein Expression in Bacillus licheniformis
Jinlian Li,
Fengxu Xiao,
Liang Zhang,
Guiyang Shi and
Youran Li
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孢子形成是细菌中一种复杂的代谢重编程过程，会大量消耗资源。本研究利用CRISPR-Cpf1基因编辑技术，在地衣芽孢杆菌中敲除了关键孢子形成基因spoIIE和rsfA。研究发现，阻断孢子形成虽然降低了菌体生物量，但显著提升了单位细胞的葡萄糖消耗、乙偶姻（Acetoin）和2,3-丁二醇（2,3-BD）的合成能力，尤其使外源蛋白（eGFP）表达水平提升了10-15倍。这项研究为改造和设计高性能的工业微生物细胞工厂提供了新策略。
在微生物工业领域，地衣芽孢杆菌因其强大的蛋白分泌能力和环境耐受性，被视为极具潜力的“细胞工厂”，用于生产酶制剂、化学品（如2,3-丁二醇）以及生物燃料。然而，这位“工业明星”有一个与生俱来的特性——在环境胁迫下会启动复杂的孢子形成程序。这个过程犹如让工厂进入“冬眠”或“备战”状态，将大量原本用于生产“产品”的宝贵资源（能量、碳源、氨基酸）转而投入到构建一个高度抗逆但代谢停滞的孢子“休眠舱”中。这不仅导致生产周期延长，更关键的是，孢子形成过程中复杂的基因调控网络可能会抑制与生长相关的代谢途径，从而限制了“细胞工厂”在发酵过程中的持续高效产出。那么，能否通过基因工程手段“说服”这位“明星工人”放弃这项耗资巨大的“自保项目”，将全部精力集中于“增产创收”呢？这正是本研究所要探索的核心问题。
为了回答这个问题，研究人员在发表于《Microorganisms》期刊上的论文中，运用了CRISPR-Cpf1（也称为Cas12a）基因编辑系统，精准地敲除了地衣芽孢杆菌CICIM B1319菌株中的两个关键孢子形成基因——spoIIE和rsfA。spoIIE是孢子形成II期的关键调控基因，负责不对称分裂的启动；而rsfA则在孢子形成的不同阶段起作用。研究人员通过构建ΔspoIIE和ΔrsfA基因敲除菌株，并利用相衬显微镜观察细胞形态变化，建立了一套可靠的孢子形成率定量检测方法（基于热处理和菌落计数）。为了全面评估基因敲除的影响，他们采用高效液相色谱法检测了菌株在合成培养基中发酵过程中的葡萄糖消耗以及乙偶姻和2,3-丁二醇的产量动态。同时，研究人员还引入了增强型绿色荧光蛋白作为报告蛋白，通过检测荧光强度来定量评估菌株的异源蛋白表达能力。通过对比野生型菌株与两个敲除菌株在生长、孢子形成、代谢物合成及蛋白表达等多方面的表现，该研究系统地揭示了阻断孢子形成对细胞生理状态和代谢生产力的深远影响。
3.1. 关键孢子形成基因的筛选与鉴定
通过文献调研，研究人员筛选出在孢子形成不同阶段发挥作用的spoIIE和rsfA作为研究靶点。spoIIE已被广泛研究，是II期孢子形成的关键调控因子；而rsfA相关研究较少，主要在σF因子调控下表达于前孢子中。选择这两个基因有助于从不同角度探究孢子形成与生长代谢表型的关联。
3.2. 利用CRISPR-Cpf1系统构建孢子形成缺陷型敲除菌株ΔspoIIE和ΔrsfA
研究成功利用CRISPR-Cpf1系统构建了重组质粒，并电转化至地衣芽孢杆菌中，经筛选和质粒消除后，获得了ΔspoIIE和ΔrsfA敲除菌株。聚合酶链式反应和测序结果证实，spoIIE基因有2452 bp的缺失，rsfA基因有735 bp的缺失，与预期一致。其中，spoIIE的敲除效率达到100%，而rsfA为40%。
3.3. 孢子形成基因敲除前后的细胞形态
相衬显微镜观察显示，野生型菌株细胞形态规则，可观察到典型的、高折射率的椭圆型内生孢子。相比之下，ΔspoIIE突变株细胞显著伸长，呈丝状结构，内部缺乏正常的隔膜，完全无法形成成熟孢子。ΔrsfA突变株细胞形态不规则，出现扭曲、肿胀或变窄等异常，内部可见不完整的隔膜结构，同样完全缺乏高折射率的成熟孢子。这些形态学观察支持了SpoIIE和RsfA在孢子形成不同阶段的作用。
3.4. 地衣芽孢杆菌孢子形成率检测方法的建立
研究人员通过系列实验优化了孢子形成率的检测方法。他们发现，延长热处理时间（如30分钟）会杀死部分热敏感孢子，导致检测结果偏低，最终确定80°C热处理10分钟为最佳条件。在培养基筛选方面，无葡萄糖的LB2基础培养基最适合孢子形成，在培养72小时时孢子形成率可达约99%，而含30 g/L葡萄糖的合成培养基或LB1培养基的孢子形成率则低得多。这证实了碳源限制是启动高效孢子形成的关键信号。
3.5. 敲除菌株的生长、代谢及孢子形成率分析
利用建立的检测方法，研究人员发现ΔspoIIE菌株完全丧失了孢子形成能力（0%），而ΔrsfA菌株的最大孢子形成率约为74%（野生型约为99%）。尽管敲除菌株的活细胞总数显著下降（ΔspoIIE下降80.7%，ΔrsfA下降45.7%），但在培养物水平上，它们的葡萄糖消耗以及乙偶姻和2,3-丁二醇的总产量与野生型菌株相比没有显著差异。然而，当以活细胞计数为基准计算单位细胞的代谢能力时，出现了戏剧性的变化：ΔspoIIE和ΔrsfA菌株的单位细胞葡萄糖消耗速率提升了2.7-3.4倍，乙偶姻合成速率提升了2.3-4.2倍，2,3-丁二醇合成速率提升了1.7倍。
3.6. 孢子形成缺陷对荧光蛋白表达的影响
在引入增强型绿色荧光蛋白表达质粒后，孢子形成缺陷菌株在总荧光强度上与野生型菌株相近甚至略高。但当荧光强度以单位活细胞进行标准化后，数据显示ΔspoIIE和ΔrsfA菌株的单位细胞异源蛋白表达能力相比野生型菌株提升了10-15倍。
该研究的结论与讨论部分深刻阐释了其发现的重要意义。研究结果表明，孢子形成是一个极其“昂贵”的过程，需要消耗大量的肽聚糖、蛋白质、吡啶二羧酸以及ATP、NADPH等能量和还原力。当通过基因敲除阻断这一途径后，细胞避免了将资源“浪费”在构建代谢停滞的孢子上，从而可以将更多的资源和能量重新分配给维持营养细胞活性和目标产物合成。
其次，孢子形成缺陷影响了细胞群体的生理稳定性和异质性。在发酵后期，野生型菌群处于高度异质状态，包含营养细胞、处于不同孢子形成阶段的细胞、成熟的惰性孢子以及衰老细胞，其中只有营养细胞是代谢产物的主要贡献者。而孢子形成缺陷菌株的群体主要由代谢活跃的营养细胞构成，避免了资源被低效或无效的细胞所消耗，使得整个细胞群体处于更稳定、均一的高效工作状态。
更重要的是，孢子形成缺陷解除了代谢调控负担。孢子形成涉及一个由级联σ因子控制的庞大调控网络，影响着超过500个基因的表达。在野生型菌株中，为了确保孢子形成的资源分配，细胞会关闭大量与营养生长相关的基础代谢和蛋白合成机制。在孢子形成缺陷菌株中，这种全局性的生长抑制被极大削弱，外源蛋白得以在竞争性抑制因子更少的环境中表达，从而显著提升了单位细胞的蛋白表达容量。
此外，研究还指出了传统用光密度值评估孢子形成菌生长的局限性。在孢子形成和营养细胞自溶的阶段，培养液浊度下降，但孢子数量可能很高且稳定，导致OD600与孢子形成率变化不同步。因此，使用活菌计数更能准确反映这类菌株的生物量，这也是本研究能计算出单位细胞代谢能力显著提升的关键。
综上所述，这项研究通过精准的基因编辑，首次在地衣芽孢杆菌中系统揭示了阻断孢子形成与解放细胞代谢生产力之间的直接关联。它证明，通过“关闭”耗能的孢子形成程序，可以迫使“细胞工厂”从“备战模式”切换到“全力生产模式”，尽管工人（活细胞）总数减少了，但每位工人的工作效率（单位细胞比生产率）却得到了数倍乃至十数倍的提升。这一发现不仅深化了对细菌孢子形成生理学的理解，更重要的是为代谢工程和合成生物学领域提供了一种全新的策略：即通过干预细胞发育程序，而非传统的途径强化，来重塑微生物的代谢流向，从而构建更高性能的工业微生物细胞工厂，用于高效生产化学品、酶制剂和生物药物。
