GmMYB21a通过ROS清除和类黄酮合成增强大豆CMS恢复系在高温胁迫下的雄性育性

《Plants》：GmMYB21a Improves Male Fertility of CMS-Based Restorer Line Under High-Temperature Stress in Soybean Jilei Gan, Hongjie Wang, Yujuan Gu, Xianlong Ding and Shouping Yang

为解决高温胁迫下杂交大豆恢复系雄性育性不稳定的产业难题，本研究揭示了MYB转录因子GmMYB21a通过调控活性氧(ROS)清除和类黄酮合成途径，正调控大豆花粉活力和萌发，从而增强雄性耐热性的分子机制。这为培育耐高温大豆恢复系提供了关键基因资源和理论依据。

　　

高温天气是现代农业面临的严峻挑战，尤其在作物开花期，过高的温度常常导致花粉“中暑”死亡，造成农作物大幅减产。大豆作为全球最重要的油料和蛋白作物之一，其杂交种具有显著的产量优势，但这种优势的实现高度依赖于雄性不育系(CMS)和恢复系的完美配合。然而，一个棘手的问题是，某些基于CMS的杂交大豆组合，其雄性育性对环境温度极为敏感，高温(HT)胁迫会直接导致恢复系的“战斗力”下降——花粉失去活力，使得杂交优势无法发挥，最终影响种子产量。这一问题的核心在于不同恢复系对高温的耐受性存在差异，而背后的分子调控机制尚不清晰。为了破解这一难题，挖掘能够赋予恢复系高温耐受性的关键基因并阐明其作用机理，对于培育高产、稳产的耐高温杂交大豆品种具有迫切的现实意义和巨大的应用潜力。

为开展这项研究，作者运用了多项关键的实验技术。研究材料使用了来自中国南京国家大豆改良中心的大豆细胞质雄性不育系NJCMS1A及其恢复系（包括耐高温的N4608、高温敏感的YY6以及本研究的受体材料Tianlong No.1）。关键的技术方法包括：通过CRISPR/Cas9系统构建GmMYB21a基因敲除突变体，以及通过农杆菌介导的遗传转化获得GmMYB21a过表达株系，用于功能验证。利用RNA原位杂交技术定位基因的表达部位，并通过花粉I₂-KI染色、体外花粉萌发实验评估雄性育性。采用CM-H₂DCFDA荧光染色检测活性氧(ROS)水平，DPBA染色定性检测花粉中黄酮醇（如山奈酚）含量。通过比较转录组测序(RNA-Seq)分析差异表达基因，并结合酵母单杂交(Y1H)、电泳迁移率变动分析(EMSA)和双荧光素酶报告基因检测等分子互作实验，验证转录因子与下游靶基因的调控关系。

2.1. Characterization of Soybean GmMYB21a

研究人员首先对GmMYB21a进行了特征分析。通过序列比对和进化分析，发现GmMYB21a编码一个含有R2R3结构域的MYB转录因子，与大豆近缘种Glycine soja的GsMYB305以及拟南芥的AtMYB21/AtMYB24同源关系最近。酵母反式激活实验证明GmMYB21a具有转录激活活性。表达模式分析显示，在高温胁迫下，GmMYB21a在耐高温恢复系N4608中的表达量显著高于高温敏感恢复系YY6。更为重要的是，RNA原位杂交结果显示，GmMYB21a的mRNA特异性地定位在大豆花粉中，暗示其可能在调控雄性生殖发育中发挥作用。亚细胞定位实验证实GmMYB21a蛋白定位于细胞核。

2.2. GmMYB21a Positively Regulates Male Fertility of Restorer Line Under HT Stress

为了明确GmMYB21a的功能，研究团队在恢复系TL1背景下创建了GmMYB21a的过表达株系和CRISPR/Cas9敲除突变体。在正常温度(NT)下，各材料的花粉活力和萌发率无显著差异。然而，在高温胁迫下，过表达株系GmMYB21a-OE1和GmMYB21a-OE2的花粉活力和萌发率均显著高于受体TL1，而敲除突变体Gmmyb21a-1和Gmmyb21a-2则显著低于TL1，表明GmMYB21a正向调控恢复系在高温下的雄性育性。进一步通过CM-H₂DCFDA染色检测花药中的活性氧水平，发现过表达株系在高温下积累了更少的ROS，而敲除突变体则积累了更多的ROS，提示GmMYB21a可能通过调节ROS稳态来发挥作用。

2.3. GmMYB21a Positively Regulates Male Fertility of Hybrid F₁Under HT Stress

为了验证GmMYB21a在杂交后代中的功能，研究者将CMS系NJCMS1A分别与TL1、GmMYB21a-OE2和Gmmyb21a-1杂交，获得相应的F₁代。高温胁迫实验表明，过表达父本衍生的F₁代（1A × GmMYB21a-OE2）花粉活力更高、ROS积累更少；而敲除父本衍生的F₁代（1A × Gmmyb21a-1）则表现出相反的表型。这证实了恢复系中GmMYB21a的表达水平直接影响其杂交F₁代在高温下的雄性育性。

2.4. GmMYB21a Affects Flavonoid Biosynthesis and Stress Response Under HT Stress

通过对GmMYB21a-OE2和TL1的花蕾进行转录组比较分析，发现过表达株系中有813个差异表达基因(DEGs)。KEGG富集分析显示，这些基因显著富集在类黄酮生物合成等通路。具体而言，多个与类黄酮合成、糖代谢、植物激素信号和应激反应相关的基因在过表达株系中上调，包括苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查尔酮合成酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)等基因。启动子分析发现这些基因的启动子区含有MYB结合位点(MBS)，暗示它们可能是GmMYB21a的直接靶标。

2.5. GmMYB21a Directly Binds to the GmCHI2-A Promoter

分子实验证实了上述推测。酵母单杂交(Y1H)和电泳迁移率变动分析(EMSA)实验均证明，GmMYB21a能够直接结合到类黄酮合成关键基因GmCHI2-A启动子的MBS motif (CAACAG)上。双荧光素酶报告基因实验进一步表明，GmMYB21a可以显著激活GmCHI2-A启动子的转录活性。这些结果确定了GmCHI2-A是GmMYB21a的直接下游靶基因。

2.6. GmMYB21a Participates in Kaempferol Biosynthesis

类黄酮（特别是黄酮醇）是有效的ROS清除剂。通过DPBA染色对花粉中的山奈酚（一种黄酮醇）进行定性检测，发现无论在正常还是高温条件下，GmMYB21a过表达株系的花粉中山奈酚含量均显著高于TL1，而敲除突变体则显著低于TL1。这表明GmMYB21a通过激活GmCHI2-A等基因，促进了类黄酮（尤其是山奈酚）的生物合成，从而有助于清除高温胁迫下积累的ROS。

归纳研究结论和讨论部分，强调其重要意义

本研究系统阐明了MYB转录因子GmMYB21a增强大豆CMS恢复系雄性耐热性的分子机制。结论明确指出，GmMYB21a是一个在花粉中特异性表达、受高温诱导的转录激活因子。功能上，它正向调控大豆恢复系及其杂交F₁代在高温胁迫下的雄性育性。机制上，GmMYB21a通过直接结合并激活类黄酮生物合成途径关键基因GmCHI2-A的启动子，促进山奈酚等类黄酮物质的积累，从而增强细胞的抗氧化防御能力，有效清除高温胁迫下产生的过量活性氧(ROS)，维持花粉的正常活力和萌发。

这项研究的科学意义在于，首次揭示了一条由MYB转录因子GmMYB21a介导的、通过调控类黄酮合成来增强大豆雄性耐热性的新通路，深化了对植物高温胁迫响应，特别是雄性生殖发育耐热性分子机制的理解。其实用价值更为突出：GmMYB21a被鉴定为一个可同时提升高温耐受性和雄性育性的关键基因，为分子设计育种提供了宝贵的遗传资源。通过将此类基因导入恢复系，有望培育出耐高温、强恢复力的新种质，从而从根本上解决高温导致杂交大豆雄性不育和产量不稳的产业瓶颈问题，对于保障大豆生产安全、挖掘杂交大豆产量潜力具有重要的战略意义。相关研究成果已发表在学术期刊《Plants》上。